التثقيب الكهربائي لخلية واحدة في مزارع شرائح الدماغ العضوية: تقنية في المختبر لتوصيل البلازميدات داخل الخلايا العصبية المستهدفة في شرائح الحصين في الدماغ

ابدأ التثقيب الكهربائي عن طريق أخذ ماصة زجاجية تحتوي على محلول البلازميد المطلوب. قم بتثبيته بحامل ماصة دقيقة مزود بقطب كهربائي من الأسلاك الفضية، مما يضمن إدخال القطب الكهربائي في الماصة الدقيقة. خذ حجرة التثقيب الكهربائي التي تحتوي على قسم حصين رفيع للغاية مغمور في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي.

اغمس القطب الأرضي في السائل الموجود في الغرفة للتثقيب الكهربائي اللاحق. اخفض طرف الماصة في حجرة التثقيب الكهربائي وسجل مقاومة خط الأساس. استخدم مجهرا لوضع طرف الماصة بالقرب من الخلية المستهدفة. بمجرد ملامسة الماصة للغشاء العصبي ، تزداد مقاومتها بشكل حاد.

قم بتطبيق ضغط هواء إيجابي لإنشاء غزو صغير في الغشاء العصبي. قم بتطبيق شفط خفيف بسرعة لدفع الغشاء لأعلى ، مما يؤدي إلى إنشاء مانع تسرب فضفاض بين طرف الماصة والغشاء. كرر هذه العملية عدة مرات لتكييف الغشاء وتجنب تحلل الخلايا.

بعد التكييف ، قم بتطبيق شفط قوي لتشكيل ختم محكم بغشاء يسمى ختم gigaohm. استخدم النبضات الكهربائية لتشكيل مسام عابرة في المنطقة المغلقة من الغشاء. تسهل هذه الفتحات دخول البلازميدات داخل الخلايا العصبية المستهدفة. بعد التثقيب الكهربائي ، تعيد المسام الإغلاق ، وتحبس البلازميدات داخل الخلايا العصبية.

لتحضير مزارع الشرائح للتثقيب الكهربائي ، انقل إدخالات الثقافة ذات الأهمية إلى أطباق بتري فردية بطول 3 سم محملة ب 900 ميكرولتر من وسط الاستزراع وضع الثقافات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون على الطاولة. بعد ذلك ، قم باحتضان إدخالات الثقافة الطازجة مسبقا مع 1 مليلتر من وسط زراعة الشرائح لكل إدراج في طبق بتري بطول 3.5 سم لمدة 30 دقيقة على الأقل ، وقم بتعقيم خطوط جهاز التثقيب الكهربائي باستخدام مبيض بنسبة 10٪ لمدة 5 دقائق.

في نهاية التروية ، اشطف الخطوط بالماء المعقمة المتأين لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الترشيح باستخدام aCSF المعقم بالترشيح الذي يحتوي على 0.001 مللي مولر رباعي السموف. اضبط نبضة المثقور الكهربائي على سعة سالب 5 فولت ، ونبضة مربعة ، وقطار 500 مللي ثانية ، وتردد 50 هرتز ، وعرض نبضة 500 ميكروثانية. املأ ماصة زجاجية ب 5 ميكرولترات من المحلول الداخلي المحتوي على البلازميد وقم بنقر الطرف برفق واضغط عليه عدة مرات لإزالة أي فقاعات عالقة.

استخدم مجهر التشريح للتأكد من عدم تلف الطرف وقم بتوصيل طرف الماصة بإحكام بالقطب. عندما يتلامس الطرف مع aCSF، سجل قراءة مقاومة الماصة للمثقب الكهربائي. لعزل ثقافة الشريحة ، قم بقص غشاء إدخال المزرعة بشفرة حادة واستخدم ملقطا حادا الزاوية لنقل ثقافة الشريحة بعناية إلى غرفة التثقيب الكهربائي. ثم قم بإصلاح موضع الثقافة باستخدام مرساة شريحة.

للتثقيب الكهربائي للخلايا ذات الأهمية، قم بالضغط الإيجابي على الماصة عن طريق الفم واستخدم أدوات التحكم في المقبض ثلاثي الأبعاد لمناورة طرف الماصة بالقرب من سطح مزرعة الشرائح. عند عرض الثقافة بالمجهر ، اقترب من الخلية المستهدفة بالحافة ، مع الحفاظ على الضغط الإيجابي المطبق حتى تتشكل غمازة على سطح الخلية. عند تصور الدمل ، قم بتطبيق ضغط سلبي خفيف بسرعة عن طريق الفم بحيث يتشكل ختم فضفاض بين طرف الماصة وغشاء البلازما.

سوف يدخل الغشاء قليلا إلى الماصة. يجب ملاحظة زيادة بمقدار 2.5 مرة تقريبا في المقاومة الأولية للماصة، كما يتضح من زيادة النغمة من مكبرات الصوت. أعد تطبيق الضغط الإيجابي بسرعة حتى يتم إصلاح الدمل. بعد ذلك ، أكمل على الفور دورتين أخريين على الأقل للضغط كما هو موضح للتو دون توقف. بعد نبضة الضغط الأخيرة ، استمر في الضغط السلبي لمدة 1 ثانية. تصل النغمة من مكبرات الصوت إلى قمة مستقرة في درجة الصوت. استخدم دواسة القدم لنبض المثقب الكهربائي بسرعة.

بعد التثقيب الكهربائي ، اسحب الماصة برفق حوالي 100 ميكرون من الخلية دون الضغط وأعد الضغط الإيجابي ، مع التحقق من أن المقاومة تشبه قراءة خط الأساس قبل الاقتراب من الخلية التالية. عندما يتم تثقيب جميع الخلايا ذات الأهمية بالكهرباء ، انقل ثقافة الشرائح إلى أحد إدخالات الثقافة الطازجة المحضرة وضع الملحق عند 35 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.