عزل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي: إجراء تدرج الكثافة لعزل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي لحديثي الولادة للدراسات في المختبر

لعزل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي، خذ عمودا فقريا لفأر حديثي الولادة وضعه على طبق بتري. اغسل العمود الفقري بمحلول ملحي لتحرير الحبل الشوكي. نقل الحبل الشوكي إلى وسط عصبي بارد لتعزيز بقاء الخلية.

بعد ذلك ، قم بفرم الحبل الشوكي ونقل الشظايا إلى أنبوب يحتوي على وسط عصبي جديد. احتضان الأنبوب في حمام مائي شاكر للتأقلم. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط المستهلك وأضف وسط الهضم. تشق الإنزيمات الهاضمة مصفوفة الأنسجة لتفكيك الخلايا.

قم بإجراء التجربة عن طريق شفط شظايا الأنسجة في الماصة وتفريغ المكونات بسرعة ، وإطلاق الخلايا الفردية في التعليق. بعد ذلك ، قم بنقل هذا التعليق إلى أنبوب يحتوي على وسط تدرج الكثافة وجهاز طرد مركزي.

بعد الطرد المركزي ، تحتوي الطبقة السطحية للأنبوب على بقايا الأنسجة. تشمل الطبقة الأولى الخلايا قليلة التغصن والخلايا النجمية. تتكون الطبقتان الثانية والثالثة من الخلايا العصبية ، حيث تتمتع الطبقة الثالثة بأعلى نقاء. أخيرا ، تحتوي الحبيبات على خلايا دبقية صغيرة.

اجمع الطبقة الثالثة في أنبوب جديد وأضف وسطا عصبيا لتخفيف وسط تدرج الكثافة. جهاز طرد مركزي لتكوير الخلايا العصبية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في وسط عصبي القاعدي للحفاظ على الخلايا العصبية لمزيد من التجارب.

لبدء هذا الإجراء ، افصل الرأس عن جسم صغار الفأر الرحيم باستخدام المقص. بعد ذلك ، قم بتثبيت الذيل والذراعين على طاولة الإجراءات بحيث يكون الجانب الظهري متجها لأعلى. ثم اقطع الجلد باستخدام مقص القزحية المنحني. بعد ذلك ، قم بقطع الحبل الشوكي من منطقة أسفل الظهر فوق الوركين مباشرة ثم قم بقطع جانبي الصدر لفصله عن الجسم.

اغسل العينات بالتتابع في ثلاثة أطباق بتري بطول 10 سم تحتوي على 5 ملليلتر من PBS المعقم لمدة 10 ثوان لكل منها لإزالة الأنسجة الزائدة. بعد ذلك ، أدخل إبرة وحقنة قياس 22 مملوءة ب 5 ملليلتر من PBS المعقم في الطرف الذيلي للعمود الفقري وقم بغسلها في الجمجمة ، مما يسمح للسلك بالخروج إلى طبق بتري رابع.

انقل الحبل الشوكي في أنبوب سعة 15 مليلتر مع 5 ملليلتر من HABG على الثلج. تجنب سحق الحبل الشوكي وكرر الإجراءات لبقية الجراء. من الناحية المثالية ، يجب ألا تستغرق هذه العملية أكثر من 30 دقيقة لمجموعة واحدة من الجراء لضمان عزل الخلايا العصبية الصحي.

لتحضير تدرج الكثافة ، قم بإعداد كل طبقة من الطبقات الأربع في أربعة أنابيب سعة 15 مل. ثم أضف 1 مليلتر من كل طبقة إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. ابدأ بالطبقة 1 في الأسفل وأضفها بالتتابع حتى تصل إلى الطبقة 4 في الأعلى. تجنب إزعاج الطبقات أثناء الإضافة وأي حركات قوية قد تسبب الاختلاط. بعد ذلك ، أضف وسائط الهضم إلى الأنسجة المفرومة. ضع العينة في شاكر في حمام مائي على حرارة 30 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنسجة من الحمام المائي واتركها تستقر لبضع دقائق.

لأداء التجربة ، استنشق وسط الهضم الزائد. الأنسجة في 2 مل من HABG. باستخدام ماصة ضيقة التجويف، قم بترتيتر 10 مرات في 45 ثانية وتجنب إدخال الهواء لأنها ستقلل بشكل كبير من الإنتاجية القابلة للحياة. يعد التجربة أحد أهم خطوات الإجراء. يجب سحب الأنسجة بعناية إلى الماصة المصقولة بالنار وإفراغها منها ، وتجنب القوة الزائدة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا العصبية ، أو أن تكون لطيفة جدا ، مما يؤدي إلى انخفاض الإنتاجية.

بعد ذلك ، استنشق أعلى 2 مل من المادة الطافية وقم بنقلها إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر يسمى "مجموعة". كرر إجراءات التجميع مرتين أخريين للحصول على 6 ملليلتر من المادة الطافية. بعد ذلك ، انقل محتويات أنبوب التجميع ببطء إلى أنبوب التدرج المعد مسبقا ، وتجنب تعطيل التدرج.

لتنقية الخلايا العصبية ، قم بالطرد المركزي لأنبوب التدرج لمدة 15 دقيقة عند 800 × جم و 22 درجة مئوية. اجمع الطبقات المرغوبة وانقلها في أنبوب جديد سعة 15 مل. للحصول على أعلى عزل للخلايا العصبية نقاء ، اجمع الطبقة 3. لمزيد من الغلة مع نقاء أقل ، اجمع الطبقات من 2 إلى 3.

بعد ذلك ، قم بتخفيف تدرج الكثافة بإضافة 5 مل من HABG إلى الطبقات التي تم جمعها حديثا. جهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة دقيقتين عند 22 درجة مئوية. بعد دقيقتين ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5 ملليلتر من HABG عن طريق النقر على الحبيبات. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 200 × جم لمدة دقيقتين عند 22 درجة مئوية مرة أخرى. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 3 ملليلتر من الوسط العصبي عن طريق النقر على الحبيبات.