عزل الحليمات المحيطة (CVP) بالظهارة من نموذج الفأر: إجراء إنزيمي لفصل ظهارة CVP عن لسان الفأر

السطح الظهري لسان الفأر مغطى بثلاثة أنواع رئيسية من النتوءات المرتفعة تسمى الحليمات ، وهي الحليمات الفطرية ، والمحيطية ، والحليمات الخيطية. الحليمات المحيطة ، أو CVP ، التي تتكون من خنادق ظهارية تحتوي على براعم التذوق ، مدعومة بطبقة من النسيج الضام - الصفيحة الخاصة.

لعزل ظهارة CVP ، ابدأ بفأر قتل رحيم في وضع ضعيف. بعد ذلك ، قم بشق الخدين وتشريح الشريط السميك من الأنسجة - اللجام اللساني - لفصل اللسان عن أرضية تجويف الفم. انقل اللسان المستأصل إلى طبق يحتوي على عازلة مبردة.

بعد ذلك ، اقطع الجزء الأمامي من اللسان. قم بحقن كوكتيل الهضم الذي يحتوي على إنزيمات التباين والكولاجيناز بعناية في الفضاء تحت الظهارة لمنطقة CVP ، بين الظهارة والأنسجة الأساسية. اسحب الإبرة أثناء حقن المعلق في المنطقة.

احتضان اللسان للمدة المناسبة. تهضم التباينات والكولاجيناز بروتينات المصفوفة خارج الخلية داخل النسيج الضام ، مما يسهل فصل ظهارة CVP عن الأنسجة. بعد الحضانة ، قم بعمل شقوق في الظهارة في منطقة CVP.

افصل الظهارة المخففة برفق عن الأنسجة الأساسية. أخيرا ، انقل ظهارة CVP المنفصلة إلى أنبوب مغطى بالبروتين لمنع الأنسجة من الالتصاق بجدار الأنبوب. يمكن تخزين ظهارة CVP لمزيد من المعالجة النهائية.

بعد القتل الرحيم لفأر بالغ ، استخدم مقصا كبيرا معقما لقطع الخدين وكسر الفك. ثم ارفع اللسان واقطع اللجام اللساني لفصل اللسان عن أرضية تجويف الفم. اقطع اللسان واجمعه في dPBS معقم مثلج مع الكالسيوم والمغنيسيوم.

تحت مجهر تشريح ، قم بإزالة اللسان الأمامي والتخلص منه عن طريق قطع الجزء الأمامي من اللسان بين الضخار بشفرة حلاقة. ثم ، باستخدام مسح دقيق لإزالة أي شعر وسوائل زائدة من اللسان الخلفي.

بعد ذلك ، املأ حقنة سعة 1 مليلتر ب 200 إلى 300 ميكرولتر من محلول إنزيم الحقن وأدخل إبرة قياس 30 بوصة 1/2 بوصة فوق السمو بين الضخار مباشرة حتى داخل الحليمات المحيطة أو CVP. حقن محلول الإنزيم أسفل وعند الحواف الجانبية ل CVP بين الظهارة والأنسجة الأساسية. اسحب المحقنة ببطء وبشكل مستمر من اللسان أثناء حقن المحلول.

احتضان اللسان في dPBS معقم خال من الكالسيوم / المغنيسيوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 33 دقيقة بالضبط. باستخدام مقص تشريح دقيق للغاية ، قم بعمل جروح صغيرة في الظهارة بشكل ثنائي وأمام CVP. ثم قشر الظهارة برفق عن طريق رفعها بالملقط الدقيق. بمجرد أن تصبح ظهارة الخندق خالية من النسيج الضام الأساسي ، ضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر مغطى مسبقا ب FBS.