عزل البكتيريا الملتحمة المساندة على المسحة: تقنية لعزل البكتيريا المتوافقة عن الملتحمة لنموذج الفئران

ملتحمة العين تؤوي بكتيريا تعايشية. تحمي هذه البكتيريا الأصلية العين من العدوى عن طريق تنشيط الخلايا المناعية لمهاجمة أي ميكروبات ضارة تدخل بطانات العين.

لعزل البكتيريا المتعايشة ، ضع فأر مخدر في وضع جانبي. خذ مسحة معقمة للعين مغموسة في وسط مناسب. أدخل طرف المسحة المبللة في منطقة الملتحمة الإنسية للعين اليسرى. اضغط على مقلة العين وحرك المسحة ذهابا وإيابا على طول الملتحمة لجمع مجموعة متنوعة من السكان.

قم بإزالة المسحة وحركها في أنبوب يحتوي على وسائط تخصيب ميكروبية. تطلق هذه الخطوة البكتيريا المحاصرة من شبكة القطن للمسحة في الوسائط. تخلص من المسحة واحتضان الأنبوب لتسهيل ظهور نمو البكتيريا.

ضعي بضع قطرات من الوسائط المخصبة الملقحة بمسحة العين على صفيحة أجار الدم بالنمط المطلوب واحتضنها. يوفر الكازين وببتون الصويا الموجودان في الوسائط النيتروجين اللازم لتخليق الببتيد بينما يحافظ كلوريد الصوديوم على التوازن التناضحي.

البكتيريا التوافقية إنزيمات الهيموليسين التي تهضم الهيموجلوبين الموجود في وسط الدم. ينتج عن هذا نمطا مميزا على صفيحة الأجار ، مما يتسبب في تكاثر البكتيريا المختلفة في مستعمرات متميزة شكليا. احسب عدد المستعمرات لتحديد وفرة نسبية في الملتحمة.

تأكد من تخدير الفأر بشكل صحيح عن طريق الضغط على وسادة القدم الخلفية. تابع فقط إذا لم تكن هناك حركة. قم بتعيين يد واحدة للتعامل مع الفئران المخدرة واليد الأخرى للتعامل مع مسحة العين والثقافة. أخرج الماوس من القفص وضعه فوق سطح العمل الموجود على جانبه مع كشواف العين اليسرى. رش اليدين القفازات بالأيزوبروبانول وجففهما بمنشفة ورقية.

قم بفك غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق BHI المسمى باستخدام يد معالجة الوسائط المخصصة وضع الأنبوب مرة أخرى في الرف. اغمس طرف مسحة العين المطلية بالقطن في BHI. بعد ذلك ، اسحب المسحة من الأنبوب أثناء تحريك الطرف مرتين على الأنبوب الداخلي لإزالة السائل الزائد وإزالته.

باستخدام يد التعامل مع الماوس ، أمسك الماوس برفق من قفص الرقبة. من ناحية أخرى ، ضع طرف مسحة العين على منطقة الملتحمة الإنسية للعين اليسرى. اضغط برفق على مقلة العين وحرك المسحة في حركة غسل النافذة بين الجفن السفلي والعين 10 مرات ، مع الحفاظ على ضغط مستمر. دون لمس الفراء ، قم بإزالة طرف المسحة برفق بشكل عمودي على المكان الذي تم إدخاله فيه. ضع جانب قطن المسحة لأسفل مباشرة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى باستخدام وسائط BHI.

ضع قطرة عين على العين المسحة. إذا رغبت في ذلك ، احصل على مسحات من الجلد أو الفراء للحصول على عينات التحكم ، وتعقيم القفازات بشكل مناسب بين كل مسحة. عند الانتهاء ، أعد الماوس إلى القفص. دع المسحة تقف لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الجليد. بعد ذلك ، قم بتعقيم اليدين التي ترتدي القفازات وإزالة المسحة أثناء خلط الطرف في الوسائط لمدة 10 دورات. اسحب المسحة عن طريق تدوير الطرف على الجدار الداخلي للأنبوب لمدة خمس دورات وتخلص منه في حاوية بيولوجية. كرر العملية لكل ماوس.

قم بإثراء العينة عن طريق احتضان الأنابيب بشكل ثابت لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. أثناء الحضانة ، قم بتسمية لوحة TSA بدرجة حرارة الغرفة لكل مسحة عين فأر أو مسحة تحكم وقسمها إلى نصفين. قم بإزالة العينات المخصبة من الحاضنة وضعها على الثلج. دوامة العينات لفترة وجيزة لخلطها. بعد ذلك ، قم بنقل 10 ميكرولترات من العينة على لوحة TSA وإمالة اللوحة لتشكيل شريط. كرر هذا مرتين.

على الجانب الآخر من الخط الفاصل للوحة ، قم بإنشاء 10 نقاط مع 10 ميكرولتر من العينة لكل منها. احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة و 2 أيام و 4 أيام في غرفة نظيفة تمنع ألواح الأجار من الجفاف. عد المستعمرات في الشرائط. لاحظ مورفولوجيا واحسب وحدات تشكيل المستعمرة لكل مسحة للعزلات المتشابهة شكليا.