عزل الخلايا الخلالية لصمام الفأر: طريقة إنزيمية لعزل واستزراع VICs من الصمام الأبهري للفأر

الصمام الأبهري للقلب عبارة عن بنية ثلاثية النشرات تتكون من الخلايا الخلالية للصمام الداخلي أو VICs موزعة في جميع أنحاء المصفوفة الكثيفة خارج الخلية والخلايا البطانية للصمام العلوي أو VECs.

لعزل VICs ، أولا ، قم بإعداد فأر مقتل رحيم في وضع ضعيف. من خلال شق البطن والصدر في خط الوسط، كشف القلب. قم بعمل شق صغير بين الأذين الأيسر والبطين متبوعا بالتروية المالحة لتصريف الدم. قطع الشريان الأورطي الصاعد على مستوى قوس الأبهر وحصاد القلب.

بتقطيع ثلثي البطينين البعيدين والتخلص منهما قبل تشريح الجزء المتبقي من القلب طوليا للكشف عن وريقات الصمام الأبهري "على شكل حرف U". استئصال المنشورات واشطفها بمحلول عازل مبرد لإزالة الدم.

بعد ذلك ، قم بمعالجة المنشورات بمحلول كولاجيناز منخفض التركيز واحتضانه. في التركيزات المنخفضة ، يقوم الكولاجيناز - وهو إنزيم محلل للبروتين - بتفكيك المصفوفة خارج الخلية جزئيا فقط ، مما يؤدي إلى إزاحة VECs السطحية من المنشورات.

جهاز طرد مركزي واستبدال المادة الطافية المحتوية على الإنزيم بمحلول مؤقت ، ونقل الحبيبات المعلقة إلى طبق بتري. اجمع المنشورات وعالجها بمحلول كولاجيناز عالي التركيز للهضم الثاني. عند الحضانة ، يؤدي الكولاجيناز إلى تدهور المصفوفة خارج الخلية ، مما يؤدي إلى إطلاق VICs في المحلول.

جهاز طرد مركزي لحبيبات VICs وإعادة تعليقها في وسائط مناسبة. أخيرا ، قم بزرع حجم منخفض من تعليق الخلية على صفيحة متعددة الآبار لتسهيل التصاق VICs بقاع البئر. احتضان للسماح لكبار الشخصيات بالتكاثر.

قبل البدء في التجربة ، قم بتنظيف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية ومساحة العمل باستخدام 70٪ من الإيثانول وتعقيم الأدوات الجراحية لمدة 30 دقيقة. عندما يكون الإعداد الأولي جاهزا ، ابدأ بتنظيف الصدر ومنطقة البطن لفأر قتل رحيم يبلغ من العمر 8 أسابيع باستخدام الإيثانول.

باستخدام المقص ، افتح البطن وصدر الفأر. ثم اقطع بين الأذين الأيسر والبطين الأيسر بمقص جراحي صغير. قم بإزالة الدم من القلب عن طريق نقع 10 ملليلتر من PBS البارد وقطع القلب مع الحفاظ على 3 ملليمترات من الشريان الأورطي الصاعد. تحت المجهر المجسم، قم بتشريح الصمام الأبهري عن طريق قطع القلب أفقيا في منتصف البطينين وقطع البطين الأيسر باتجاه الشريان الأورطي. ثم قم بتشريح الصمام الأبهري بعناية. اجمع الصمامات معا في طبق صغير لزراعة الأنسجة مقاس 35 ملم.

اغسل الصمامات المعزولة في طبق زراعة الخلايا سعة 75 مليلتر مع 5 ملليلتر من HEPES البارد الطازج 10 ملليمولار المكمل بالمضادات الحيوية واحتضانها في 5 مل من الكولاجيناز من النوع الأول لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الرج المستمر. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 5 دقائق عند 150 × جم واغسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام 2 مل من HEPES المليمولار مع دوامة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية.

اجمع المعلق الناتج من الأنبوب إلى طبق استزراع 35 ملم واستخدم ملاقط رفيعة لنقل شظايا الأنسجة بعناية إلى أنبوب جديد. ثم, احتضان الحبيبات في أنبوب 15 ملليلتر عند 5 ملليلتر من الكولاجيناز من النوع الأول عند 37 درجة مئوية تحت التحريض المستمر لمدة 35 دقيقة. افصل الخلايا عن طريق إعادة التعليق باستخدام ماصة سعة 1 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتنظيف الخلايا مرتين عن طريق تعليق الحبيبات المنفصلة في 2 مل من DMEM الكامل والطرد المركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.

للطلاء ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من الوسط الكامل وأضفها إلى بئر واحد من طبق ثقافة الخلايا المكون من 6 آبار في الحد الأدنى من المتوسط. حافظ على الصفائح دون إزعاج عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 3 أيام من الحضانة ، تأكد من النمو بالقرب من بقايا الأنسجة من خلال مراقبة الخلايا تحت المجهر. بمجرد ظهور 1000 خلية ، قم بإزالة بقايا الأنسجة بعناية باستخدام ملاقط معقمة وقم بتغيير الوسط.