فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق ترانسفكشن جيني فعال في الجهاز العصبي المركزي للجنين للفأر في نقطة زمنية نمائية ومنطقة محددة من الدماغ. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير شعيرات دقيقة وأقطاب كهربائية من النوع الإبري لمنع تلف الرحم. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تعلم طريقة تثبيت فريدة للأجنة باستخدام كابل ضوئي من الألياف البصرية لتصور الأجنة الصغيرة من أجل الحقن الموجه للحمض النووي DNA.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إجراء التثقيب الكهربائي باستخدام أقطاب كهربائية من النوع العصوي على سطح الرحم من أجل نقل الـ DNA إلى الأجزاء السطحية من الدماغ، أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي إجراء التثقيب الكهربائي باستخدام أقطاب كهربائية من النوع الإبري في الهياكل الأكثر عمقاً في الدماغ، مثل المهاد والوطاء. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر عملية نقل محددة في الطبقة القشرية أو عملية نقل فعالة في المهاد. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الحقن التقليدي في الوسط المتعادل، في توفير رؤية وتحكم أكبر في موقع الحقن للأجنة داخل الرحم.

نستخدم كبلاً شبيهاً بالألياف الضوئية، مما يجعل من الممكن تصور الأجنة بدءاً من اليوم الجنيني E 9.5 واستخدام إبر دقيقة لنقل الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) إلى أجزاء أعمق من الدماغ، مثل المهاد والوطاء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول الدماغ النامي، مثل التمايز العصبي، وتشكيل الدماغ، والاتصال العصبي. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات نظراً لصعوبة تشكيل الإبرة والقطب الكهربائي وضبط الموضع بدقة.

إن العرض المرئي لهذه الطريقة ضروري لمعرفة كيفية صنع أقطاب إبرية دقيقة وكيفية وضع الأجنة لضمان إجراء التثقيب الكهربائي بحرية، حيث تُعد هاتان الخطوتان أساسيتين لتحقيق نتائج ناجحة. ولتجهيز الشعيرات، استخدم جهاز سحب الماصات الدقيقة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

في هذا الإجراء، نستخدم أنابيب شعرية زجاجية بقطر واحد مليمتر بدون ليف داخلي. يجب أن يتراوح طول الإبر المسحوبة من 800 ميكرومتر إلى واحد مليمتر من الطرف، مع قطر خارجي أقل من 60 ميكرومتر باستخدام مجهر تشريحي، ثم تُقص أطراف الإبر باستخدام ملقط حتى يصل القطر إلى 20 إلى 30 ميكرومتر. قم بقياس كل إبرة باستخدام الميكرومتر.

بعد ذلك، قم بتحضير الأقطاب الكهربائية الدقيقة عن طريق اللف. قم بلف أحد طرفي سلك التنجستن حول دبوس مطلي بالذهب. استخدم سلك التنجستن للأقطاب السالبة وسلك البلاتين للأقطاب الموجبة.

ثبّت السلك بالدبوس باستخدام param. ثم أدخل السلك في الساق البلاستيكية لمسحة قطنية ولف الطرفين بـ phim بالتساوي، ثم ابدأ ببرد طرف السلك بدقة باستخدام ورق صنفرة ناعم حتى يصل القطر إلى 20 to 30 micrometers عند الطرف، و 60 micrometers على مسافة تتراوح بين 800 micrometers و one millimeter من الطرف. تحقق مجدداً من الأبعاد النهائية باستخدام الميكرومتر.

بعد ذلك، اغمر السلك المدبب في قطرة من طلاء الأظافر لتطبيق طبقة رقيقة على السلك بالكامل من أجل العزل. بعد جفاف طلاء الأظافر، استخدم مسحة قطنية مبللة بالأسيتون لإزالته من آخر 200 micrometers من طرف السلك. يتم شراء الأقطاب الكهربائية البلاتينية جاهزة ولا تتطلب أي تحضير.

في هذا الإجراء، نستخدم قطب جين النبض CUY six 10 P four dash one nepo، ثم يتم تنقية DNA البلازما باستخدام طريقة maxi prep أو ما يعادلها، ونقل 100 micrograms من DNA إلى أنبوب جديد، وإضافة 10 microliters من صبغة fast green بتركيز 1%. استخدم محلول TE لزيادة الحجم إلى 100 microliters للوصول إلى تركيز نهائي من DNA البلازما يبلغ 1 microgram per microliter. اخلط المحلول برفق عن طريق الماصة، ثم قم بطرد مركزي لمحلول DNA لمدة خمس دقائق بسرعة 14,000 RPM في درجة حرارة الغرفة لإزالة الشوائب والأملاح.

انقل SNAT إلى أنبوب جديد. يمكن الاحتفاظ بمحلول DNA في درجة حرارة الغرفة داخل الأنبوب طوال فترة العملية. بعد ذلك، قم بتوصيل إبرة مسحوبة بجهاز تحكم دقيق (micro manipulator) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، ثم اغمر طرف الإبرة في محلول DNA لملء الإبرة.

ضع جهاز التحكم الدقيق جانباً بعناية واستعد للجراحة قبل البدء فيها. قم بوزن فأرة حاملة في الأيام الجنينية من 9.5 إلى 15.5 لتحديد وزن الجسم.

بعد ذلك، يتم الحقن داخل الصفاق. احقن بنثوبيتال الصوديوم بدرجة صيدلانية بجرعة 50 micrograms لكل gram من وزن الجسم والانتظار لمدة خمس دقائق. ويمكن أن تشمل بدائل بنثوبيتال الصوديوم الكيتامين، أو الزيلازين، أو الحقن، أو التخدير الغازي.

بعد التخدير، استخدم شفرة حلاقة و50%ethanol لحلاقة الشعر من منطقة البطن. جهز الجلد عن طريق الفرك المتناوب بمحلول Betadine و70%alcohol. قم بعمل شق في خط منتصف البطن باستخدام مقص دقيق.

اسحب جميع قرون الرحم بعناية فوق شاش قطني مبلل بمحلول ملحي منظم بالفوسفات أو PBS يوضع حول الجرح. حافظ على رطوبة الرحم باستخدام PBS طوال الوقت. باستخدام كابل ألياف بصرية مرن.

ضع الكبل أسفل قرن الرحم. حدد موضع الرحم بين ضوء الألياف البصرية والإبهام، ثم اضغط برفق لدفع الجنين للأعلى ليقترب من جدار الرحم. عندما يتم وضع الجنين بحيث يكون الرأس جهة اليسار وموجهاً للأعلى، أدخل الأنبوب الشعري الزجاجي بعناية في البطين المستهدف، ثم احقن حوالي 1 µL من محلول DNA لإجراء عملية التثقيب الكهربائي للطبقة القشرية الرابعة في اليوم الجنيني 13.5.

ضع أقطاب البلاتين العصوية خارج الرحم وقم بتطبيق نبضات تيار موجية مربعة خمس مرات باستخدام 38 فولت لمدة 50 ميلي ثانية. في حال استخدام التثقيب الكهربائي الدقيق للوصول إلى المهاد أو تحت المهاد في اليوم الجنيني 10.5، أدخل قطب التنغستن السالب الدقيق في البطين المحقون بالـ DNA والقطب البلاتيني الموجب في الرحم. ضع المنطقة المستهدفة بين طرفي كلا القطبين وقم بتطبيق نبضات تيار موجية مربعة مقترحة ثلاث مرات بجهد سبعة فولت لمدة 100 ميلي ثانية.

بعد اكتمال عملية التثقيب الكهربائي، أعد قرن الرحم إلى موقعه الأصلي وأضف 500 µL من PBS. قم بخياطة الطبقة الداخلية للشق باستخدام خيط جراحي، ثم أغلق الطبقة الخارجية باستخدام مشبك تلقائي بقياس 9 mm.

ضع الفأر على وسادة تدفئة لمدة ساعتين للسماح له بالتعافي من الجراحة والتخدير. يظهر هنا تطبيق التثقيب الكهربائي بالبلاتين في المنطقة القشرية في الأيام الجنينية 13.5 و14.5 و15.5. تم استخراج الأدمغة في مرحلة ما بعد الولادة.

اليوم السادس. تظهر طبقة الخلايا القشرية التي خضعت للتثقيب الكهربائي بشكل مختلف بوضوح في كل تجربة. مما يشير إلى أن التثقيب الكهربائي المعتمد على الوقت يجعل من الممكن تحقيق اكتساب أو فقدان محدد للوظيفة في الطبقات القشرية.

كما هو موضح هنا، يتم إجراء التثقيب الكهربائي في أنسجة عميقة مثل المهاد والوطاء. غالبًا ما يؤدي استخدام أقطاب البلاتين الصلبة إلى كفاءة منخفضة، لذا يُستخدم التثقيب الكهربائي باستخدام الأقطاب الدقيقة. توفر هذه الأنسجة العميقة كفاءة وقابلية حياة أفضل.

قمنا بحقن محلول DNA البلازميدي في البطين الثالث لأجنة الفئران. وفي اليوم الجنيني 11.5، طبقنا عملية التثقيب الكهربائي بالإبرة بحيث تقتصر على المهاد، حيث أن معظم محاور المهاد تمتد إلى القشرة المخية بحلول اليوم السادس بعد الولادة. ونعرض هنا عملية التثقيب الكهربائي الدقيق لـ P-C-A-G-E-Y-F-P في الرأس النامي.

تظهر منطقة المهاد بواسطة RORC، الذي يحدد جميع العصبونات المهادية ما بعد الانقسامي. كما يمكن رؤية الإسقاطات المحورية الموضحة بالأسهم البيضاء في الطبقة الرابعة من القشرة بواسطة EYFP، الذي يملأ العصبون بأكمله. كما يتم تحديد موقع الطبقة الرابعة في القشرة بواسطة جسم مضاد RORC.

بمجرد بدء عملية MA، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 15 دقيقة لكل لتر إذا نُفذت بشكل صحيح. أثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر التعامل مع الاختبار بحذر شديد لمنع حدوث أي تلف عقب اتباع هذا الإجراء. يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل دمج chromo محدد في MDNA، من أجل فهم الآلية الجزيئية لتخصيص الخلايا بعد تطورها.

تفتح هذه التقنية آفاقاً جديدة للباحثين في مجال تطور الجهاز العصبي المركزي لاستكشاف الآليات الجزيئية في التنميط، والنمو المحوري، وتشكيل الدوائر العصبية.