مقايسة القياس الكمي للعدوى البكتيرية: طريقة لتحديد الحمل البكتيري داخل العين في نموذج الفأر لالتهاب باطن المقلة الجرثومي

التهاب باطن المقلة الجرثومي هو مرض التهابي في العين يحدث عندما تصيب العصية المخيمة — وهي بكتيريا مسببة للأمراض — منطقة العين.

لتحديد كمية العدوى البكتيرية ، ضع نموذجا للفأر القتل رحيم لالتهاب باطن المقلة الجرثومي بشكل جانبي على طاولة العمليات. ضع ضغطا خفيفا تحت العين للمساعدة في فصل مقلة العين عن التجويف. انقل مقلة العين إلى أنبوب يحتوي على مخزن مؤقت مناسب مكمل بكوكتيل مثبط للبروتين.

تجانس أنسجة العين لتفكيكها ، وإطلاق البكتيريا في المعلق. تعمل مثبطات الإنزيم البروتيني الموجودة في المخزن المؤقت على تعطيل البروتياز الخلوي المنبعث للحفاظ على بقاء البكتيريا. بعد ذلك ، قم بتخفيف المعلق البكتيري بشكل متسلسل للحصول على تركيزات مختلفة من Bacillus cereus.

خذ لوحة ثقافة بزاوية تحتوي على وسط الأجار المخصب وحدد الصفوف المقابلة لكل تركيز تخفيف. قم بتوزيع بضع قطرات من المعلق البكتيري في الجزء العلوي من الصف المحدد واتركه يتدفق لأسفل حتى يصل إلى نهاية اللوحة ، مما يساعد في الانتشار المنتظم للبكتيريا. تسطيح اللوحة واحتضنها.

أثناء الحضانة ، تستخدم كل بكتيريا العناصر الغذائية من أجار لتتكاثر وتشكل مستعمرات فردية. ينخفض عدد المستعمرات ، مما يتوافق مع زيادة في تخفيف المعلق البكتيري. احسب عدد المستعمرات في صف معين لتحديد الحمل البكتيري للعين.

عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، أضف 400 ميكرولتر من PBS مكملا بمثبط الإنزيم البروتيني في أنبوب حصاد معقم مسمى لكل عين على الجليد ، ووضع ملقطا مفتوحا ورفيعا على جانبي العين المصابة. ادفع الأطراف لأسفل باتجاه الرأس لتحفيز العين.

بمجرد أن تصبح الملقط خلف كرة العين ، اضغط على الملقط معا ، واسحب الملقط بعيدا عن الرأس لفصل مقلة العين. بعد ذلك ، ضع مقلة العين على الفور في أنبوب الحصاد المسمى بشكل مناسب. في غضون 60 دقيقة من جمع العينات ، ضع أنابيب الحصاد المغلقة في مجانس الأنسجة ، وقم بتجانس العينات لمدة فترتين من التجانس مدة كل منهما دقيقة واحدة ، مع فترة راحة مدتها 30 ثانية بينهما.

بعد التجانس ، ضع العينات على الجليد ، واستخدم 20 ميكرولتر من الجانسات لتخفيف العينات بشكل متسلسل في 180 ميكرولتر من PBS لكل تخفيف حتى يتم الوصول إلى عامل 1 في 10 إلى سالب 8. بعد ذلك ، قم بتسمية كل صف من لوحة BHI المربعة الدافئة مسبقا بتركيز التخفيف المناسب ومع إمالة اللوحة بزاوية 45 درجة ، أضف 10 ميكرولتر من كل تخفيف في صفوف فردية في الجزء العلوي من اللوحة. دع كل عينة تعمل حتى تصل تقريبا إلى قاع اللوحة قبل وضع اللوحة بشكل مسطح. عندما يتم امتصاص العينات في الأجار ، انقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. يجب أن تبدأ المستعمرات في الظهور بعد ثماني ساعات من الحضانة.

للحصول على تمثيل دقيق للتركيز في العينة ، احسب الصف الذي يحتوي على ما بين 10 إلى 100 مستعمرة.