عزل خلايا IPE و RPE: تقنية للحصول على الخلايا الظهارية الصبغية العيني من عين الأرنب

الخلايا الظهارية الصبغية عبارة عن خلايا مكعبة متمايزة نهائيا متصلة بتقاطعات ضيقة. هذه الخلايا الظهارية المبطنة للقزحية هي الخلايا الظهارية أو الخلايا الظهارية أو IPE الصبغية ، وتلك القريبة من شبكية العين هي الخلايا الظهارية الصبغية أو RPE.

لاستخراج هذه الخلايا ، خذ عين أرنب سليمة. عالج العين بمطهر لإزالة أي كائنات دقيقة من سطح العين. اغسل المطهر بمحلول عازل. قم بعمل شق بالقرب من القزحية. باستخدام هذه الفتحة ، قم بعمل قطع دائري كامل على طول حدود القزحية ، وتقسيم العين إلى جزء أمامي يحتوي على قزحية وجزء خلفي يتكون من شبكية العين والخلط الزجاجي.

خذ الجزء الأمامي وتخلص من العدسة للوصول إلى القزحية. قم بإزالة القزحية وضعها في طبق ثقافة. بعد ذلك ، خذ الجزء الخلفي وتخلص من الخلط الزجاجي الجيلاتيني وشبكية العين من بصلة العين.

عالج القزحية وبصلة العين بالتربسين واحتضنها. يحلل التربسين الوصلة الضيقة وبروتينات المصفوفة خارج الخلية ، مما يؤدي إلى تفكك الخلايا الظهارية. تخلص من التربسين وأضف وسيطا مناسبا للثقافة. اكشط القزحية وسطح بصلة العين برفق لتحرير الخلايا الظهارية في الوسط.

أخيرا ، قم بزرع خلايا IPE و RPE في آبار منفصلة. الخلايا جاهزة لمزيد من المقايسات النهائية.

بعد القتل الرحيم للحيوان ، استخدم مقصا منحنيا وملقط كوليبري لاستئصال العينين ، ثم نظف الأنسجة العضلية والجلد المتبقي من العينين. اجمع العينين في أنبوب سعة 50 مليلتر مملوء ب PBS غير معقم ، وانقل الأنبوب إلى غطاء التدفق الرقائقي. قم بتطهيرها عن طريق غمرها في محلول قائم على اليود لمدة دقيقتين ، ثم انقل العينين إلى أنبوب سعة 50 مليلتر مملوء ب PBS المعقم.

ضع عين واحدة على ضغط شاش معقم ، وأمسك العين بإحكام بالقرب من العصب البصري ، ثم اقطع بالقرب من حد القزحية بمشرط # 11. باستخدام المقص ، قم بقص القزحية ، وإزالة الجزء الأمامي ، ووضعه في طبق بتري مع ترك البصلة مع الجسم الزجاجي ، حتى يتم عزل الخلايا الظهارية صبغة الشبكية ، أو خلايا RPE.

لعزل الخلايا الظهارية لصبغة القزحية ، أو خلايا IPE ، قم بإزالة العدسة باستخدام ملقط دقيق ، واسحب القزحية التي تحتوي على خلايا IPE بدقة. ضع القزحية في طبق بتري ، واغسلها باستخدام PBS معقم. أضف 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين ، واحتضن لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة التربسين ، وأضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل ، واكشط IPE بدقة باستخدام ماصة باستور مسطحة مصقولة بالنار.

اجمع تعليق الخلية ، وضعه في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. عد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer ، وبذر 0.2 مليون خلية لكل بئر في صفيحة 24 بئرا مع 1 مليلتر من الوسط الكامل. ضع الطبق في حاضنة ، وقم بزراعته عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لعزل خلايا RPE ، قم بإزالة الخلط الزجاجي وشبكية العين من الجزء الخلفي باستخدام ملقط رفيع. ضعي البصيلات في طبق 24 بئرا ، وأضيفي 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين لكل عين ، واحتضنها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة التربسين ، وأضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل لكل كرة أرضية ، واكشط خلايا RPE بدقة باستخدام ماصة باستور منحنية مصقولة بالنار.

اجمع تعليق الخلية ، وضعه في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. عد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer ، وقم بزرع الخلايا كما هو موضح سابقا. ضع الطبق في الحاضنة.