عزل الخلية البطانية الأبهرية الخنازير (pAEC): طريقة قائمة على الإنزيم لعزل الخلايا البطانية من الشريان الأورطي البطني الخنازير المحصودة

يتكون الشريان الأورطي - الشريان الرئيسي الذي ينقل الدم المؤكسج من القلب إلى الجسم - من ثلاث طبقات أو "سترات": البطى الداخلية ، والوسط الأوسط ، والوسط الخارجي. توجد الخلايا البطانية أو ECs في الجزء الداخلي كطبقة أحادية رقيقة ومستمرة فوق غشاء أساسي داعم يتكون من بروتينات هيكلية ، في المقام الأول الكولاجين.

لعزل ECs ، ابدأ بالشريان الأورطي الخنزير المحصود في طبق الاستزراع. استئصال نهاياتها وأي أنسجة ملتصقة محيطة لمنع تلوث الخلايا غير البطانية. اغسل الشريان الأورطي بمحلول يحتوي على مضادات حيوية لمنع نمو الميكروبات.

مرر خياطة جراحية معقمة عبر الشريان الأورطي واربط أحد أطرافها ، مع الحفاظ على الخيط داخل التجويف. قم بتأمين الطرف المربوط وسحب الخيط لقلب الشريان الأورطي تماما. هذا يعرض الإنتيما المحتوية على EC للهضم الأنزيمي. عالج الشريان الأورطي بمحلول كولاجيناز منخفض التركيز ودافئ مسبقا للحصول على نشاط الإنزيم الأمثل واحتضانه.

يكسر الكولاجيناز بروتينات الكولاجين الموجودة في الغشاء القاعدي الموجود تحت ECs ، مما يؤدي إلى تفككها. بعد الحضانة ، أضف عازلة مبردة لتعطيل إنزيمات الكولاجيناز.

اكشط السطح الأبهري الحممي برفق واشطفه بمحلول عازل لتحرير ECs في المحلول. الطرد المركزي هذا الحل لتكوير ECs. أعد تعليق الحبيبات في وسط مناسب. بذر معلق الخلية في قارورة ثقافة واحتضنها. تلتصق ECs بقاع القارورة وتتكاثر.

لعزل الخلايا البطانية الأبهرية الخنازير ، انقل الشريان الأورطي الخنزير إلى طبق بتري مقاس 150 ملم في ظل ظروف معقمة ، وقم بإزالة طرفي الوعاء برفق. قم بقص أي أنسجة زائدة إضافية حيث تم تثبيت الوعاء الدموي ، باستخدام ملقط ومقص معقم ، واستخدم 20 إلى 50 مل من محلول الغسيل الطازج لشطف الشريان الأورطي من الخارج والداخل.

بعد ذلك ، قم بتمرير خياطة جراحية عبر الشريان الأورطي ، واربط أحد طرفي الوعاء بشكل غير محكم ، مع الحفاظ على الخيط داخل التجويف. ثبت الشريان الأورطي برفق بالقرب من الطرف المربوط بالملقط ، ثم اسحب الغرز الجراحية ببطء لعكس الشريان الأورطي حتى ينكشف السطح البطاني للشريان الأورطي.

اغسل السطح البطاني للشريان الأورطي ثلاث مرات باستخدام 10 ملليلتر من محلول الغسيل الطازج لكل غسلة وضع الشريان الأورطي في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بتغطية العينة ب 10 ملليلتر من محلول هضمي 37 درجة مئوية 0.005٪ كولاجيناز IV دافئ ، واحتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، انقل محتويات الأنبوب بالكامل إلى طبق استزراع 100 ملم ووقف عملية الهضم باستخدام 10 إلى 15 مل من المخزن المؤقت المبرد مسبقا. باستخدام مكشطة الخلية ، قم بإزالة الخلايا البطانية الأبهرية برفق من السطح الداخلي للوعاء ، واغسل الوعاء ثلاث مرات باستخدام 5 مل من محلول الغسيل لكل غسلة.

بعد الغسيل الأخير ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر ، واغسل الجزء السفلي من طبق الثقافة مرتين باستخدام 5 ملليلتر من عازلة الغسيل الطازجة لكل غسلة ، وتجميع الغسالات في أنبوب 50 ملم.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وتخلص من جميع المواد الطافية باستثناء آخر 10 ملليلترات. أضف 20 مل من مخزن الغسيل المؤقت لإعادة تعليق الكريات ، مع الحرص على تجنب الفقاعات ، وجمع الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي آخر.

أعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من وسط زراعة الخلايا للعد ، وقم بوضع الخلايا عند 1 × 10 إلى 6 خلايا لكل تركيز قارورة 25 سم مربع. بعد ذلك ، ضع الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، مع تحديث الوسط كل 2 إلى 3 أيام.