تحميل الخرزة لإدخال الأحماض النووية في الخلايا المزروعة الملتصقة: تقنية لتحميل البلازميدات المشفرة للبروتين الفلوري في خلايا الثدييات الملتصقة

ابدأ بزراعة خلايا الثدييات الملتصقة في صفيحة الاستزراع. انقل الخرز الزجاجي المعقم بالقلويات والحجم الميكروني إلى غرفة جهاز محمل الخرز المخصص. قم بتغطية فتحة الغرفة باستخدام شبكة ذات فتحات ذات حجم مثالي للسماح للخرز بالمرور أثناء التحميل. قم بتأمين الشبكة بمجموعة غرفة التصوير.

قم بإزالة الوسائط من اللوحة. الماصة عبارة عن تعليق من الحمض النووي البلازميد المشفر للبروتين الفلوري في اللوحة لتوزيعها بشكل متساو على الخلايا. باستخدام جهاز محمل الخرزة ، قم بتفريق طبقة أحادية من الخرز الزجاجي برفق على الخلايا. اضغط على لوحة الثقافة لفترة وجيزة بقوة مناسبة.

تتدحرج الخرزات الزجاجية لفترة وجيزة فوق الخلايا الملتصقة ، في حين أن المعالجة القلوية تجعلها أقل التصاق بالخلايا. ينقل تأثير الاصطدامات بين الخرز والخلايا سلالة كافية مما يخلق اضطرابات موضعية في الأغشية الخلوية. تسهل هذه المسام العابرة ذات الأبعاد الصغيرة امتصاص الحمض النووي البلازميد في الخلايا مع منع دخول الخرز الكبير.

خلال فترة التعافي ، يعاد إغلاق الغشاء الخلوي ، ويستعيد سلامة الغشاء ويحبس الحمض النووي البلازميد. أضف الوسائط إلى اللوحة واستنشق بعناية أي حبات عائمة مرئية من اللوحة. احتضان اللوحة.

تعبر الخلايا التي تم نقلها بنجاح والتي تحتوي على الحمض النووي البلازميد عن بروتينات مراسل الفلورسنت ، والتي يمكن تصورها تحت المجهر الفلوري.

قم بإزالة الوسط من الخلايا ، واستنشق كل الوسائط برفق من حول حواف الغرفة. بعد ذلك ، قم بإمالة الغرفة بزاوية 45 درجة تقريبا ، وقم بإزالة القطرة المتبقية من الوسائط في البئر الصغير المركزي. ماصة محلول تحميل الخرزة برفق على البئر الزجاجي الموجود في وسط الغرفة.

استخدم جهاز تحميل الخرزة لتفريق طبقة أحادية من الخرز الزجاجي برفق فوق الخلايا. تأكد من أن الخرزات تغطي الخلايا بالكامل. اقرص الغرفة بإصبعين. ارفعه حوالي بوصتين ، وقم بإسقاطه بقوة باستخدام قوة تعادل تقريبا إسقاط الطبق من هذا الارتفاع.

أضف الوسط برفق مرة أخرى إلى الغرفة عن طريق سحب العينة ببطء على الجانب البلاستيكي من الغرفة. استنشاق أي حبات عائمة دون إزعاج الخلايا. يجب تنفيذ إجراء تحميل الخرزة بالكامل بسرعة نسبيا ، حتى لا تجف الخلايا عندما تكون بدون وسيط. ثم احتضان الخلايا لمدة 0.5 إلى 2 ساعة في الحاضنة.