التحول الجيني بوساطة Agrobacterium: طريقة لتحويل جينوم الأرز وراثيا عن طريق Agrobacterium tumefaciens المعدلة وراثيا

هندسة Agrobacterium tumefaciens ، وهي بكتيريا نباتية مسببة للأمراض ، وراثيا عن طريق إدخال بلازميد Ti معد صناعيا ، يحمل جينا ذا أهمية في الحمض النووي أو منطقة T-DNA المنقول ، وبلازميد مساعد يحمل جينات الفوعة أو Vir لنقل T-DNA إلى الخلايا النباتية.

للتحول الجيني بوساطة Agrobacterium ، ابدأ بإزهار أرز صغير وقم بتقطيعه إلى قطع صغيرة. انقل القصاصات إلى وسط نمو واحتضانها لتسهيل نمو القصاصات إلى كتلة خلوية غير متمايزة تسمى الكالو.

الآن ، انقل الكالس إلى وسط تسلل Agrobacterium يحتوي على acetosyringone - وهو عامل جذب كيميائي ل Agrobacterium. بعد ذلك ، أضف ثقافة Agrobacterium المعدلة وراثيا إلى الوسط واحتضانها لفترة وجيزة.

تنشط جزيئات الأسيتوسيرينجون بروتين مستقبلات الخلية - VirA - على غشاء Agrobacterium ، والذي يتوسط بشكل أكبر في فسفرة بروتين منشط النسخ - VirG. يتحرك VirG الفسفوري نحو البلازميد المساعد وينشط نسخ سلسلة من جينات الفوعة ، بما في ذلك بروتينات القناة ونوكليازات داخلية - VirD1 و VirD2.

تشكل بروتينات القناة قناة نقل تربط الخلية البكتيرية والنباتية ، بينما ترتبط نوكليازات داخلية بالتسلسلات الحدودية في بلازميد Ti وتشق T-DNA مع VirD2 ، مرتبطة في أحد طرفيها. بعد ذلك ، يوجه VirD2 دخول T-DNA عبر قناة النقل إلى خلايا الكالس ويسهل اندماجه في جينوم الأرز.

امسح كل نورة بقطعة كحول بنسبة 70٪ واتركها تجف قبل التقطيع. أحضر الإزهار إلى مقعد مختبر معقم ، وقم بتقطيعه إلى قطع صغيرة بمقص معقم. ثم انقل القصاصات إلى صفيحة بتري تحتوي على وسط NBD2.

احتضان اللوحة في الظلام عند 26 درجة مئوية ، لمدة 10 إلى 14 يوما للحث على الكالو. لإجراء التحويل ، قم بنقل مستعمرة واحدة من لوحة YEB مع المضادات الحيوية الانتقائية إلى 5 ملليلتر من وسط YEB السائل الذي يحتوي على نفس المضادات الحيوية ، في أنبوب اختبار معقم مخروطي سعة 50 ملليلترا. رج الأنبوب على شاكر مداري عند 250 × جم و 25 إلى 28 درجة مئوية حتى تنمو البكتيريا إلى OD₆₀₀ من 0.5.

أضف 1 مليلتر من المعلق البكتيري إلى 100 مل من وسط YEB مع نفس المضادات الحيوية الانتقائية ، في قارورة مخروطية سعة 250 مليلتر ، وقم بهز القارورة على شاكر مداري عند 250 × جم ، و 28 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. الطرد المركزي للثقافة عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، لجمع البكتيريا. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات بوسيط AAM-As ، وقم بتخفيف التعليق إلى OD₆₀₀ من 0.4.

بعد الحضانة ، اجمع حوالي 150 كالي صحي أصفر فاتح وجنيني في قارورة معقمة سعة 150 ملليلترا. أضف 50 إلى 75 مل من تعليق الخلية البكتيرية في القارورة ، ثم أضف 10 إلى 25 مل من وسط AAM-AS الطازج ، لغمر الكالي لمدة 10 إلى 20 دقيقة ، مع رجها من حين لآخر.

اسكب المعلق البكتيري من القارورة بعناية ، وجفف الكالي بورق ترشيح معقم. ثم ضعيها على طبق بتري مع وسيط NBD-AS ، وقم بتغطيتها بورق ترشيح. احتضن الكالي عند 25 إلى 28 درجة مئوية في الظلام لمدة ثلاثة أيام ، وافحصها بحثا عن فرط نمو البكتيريا.

بعد ثلاثة أيام من الزراعة المشتركة ، انقل الكالي إلى طبق بتري معقم باستخدام ورق الترشيح ، ثم جففه بالهواء لمدة ساعتين على مقعد نظيف. تأكد من عدم التصاق الكالي بورق الترشيح ، وقم بنقله إلى وسيط الاختيار الأساسي NBD2.

بعد أسبوعين ، انقل الكالي بالتساوي إلى طبق جديد يحتوي على وسط اختيار جديد. بعد ذلك ، انقل الكالي إلى وسط MS جديد للتمايز ، وبراعم التصوير إلى وسط MS (مع 10 مجم / لتر Hygromycin) لتكاثر المزيد من البراعم.