JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 3:59 د • July 8th, 2025
لتوصيل الحمض النووي البلازميد القائم على التثقيب الكهربائي إلى الخلايا العصبية الأولية ، ابدأ بتعليق الخلايا في وسط التثقيب الكهربائي المناسب. أضف الحمض النووي البلازميد المشفر للبروتين الفلوري لتحضير خليط التثقيب الكهربائي.
انقل خليط التثقيب الكهربائي برفق إلى كوفيت التثقيب الكهربائي ، وتجنب فقاعات الهواء التي يمكن أن تؤثر سلبا على كفاءة التثقيب الكهربائي. انقل الكوفيت إلى حامل الكوفيت الخاص بالمثقوب الكهربائي ؛ اضبط معلمات التثقيب الكهربائي. بدء التثقيب الكهربائي.
تتسبب النبضات الكهربائية القصيرة عالية الجهد المطبقة عبر غشاء الخلية في تراكم الشحنة التفاضلية على جانبي الغشاء ، مما يزيد من إمكانات الغشاء ، والجهد عبر غشاء الخلية.
عندما يتجاوز جهد الغشاء المستحث إمكانية انهيار الطبقة الدهنية الثنائية ، فإن الطبقة الدهنية الثنائية تزعزع استقرارها مع تغيير التكوين الموضعي ، وتشكل مسام عابرة محبة للماء على غشاء الخلية. توفر المسام ذات الحجم المناسب مسارا للحمض النووي البلازميدي لدخول سيتوبلازم الخلية.
عند الانتهاء من التثقيب الكهربائي ، يتم إعادة إغلاق الطبقة الدهنية الثنائية ، واستعادة سلامة طبقة ثنائية غشاء الخلية ، وبالتالي محاصرة الحمض النووي البلازميد. علاوة على ذلك ، خلال مرحلة دورة الخلية عندما يتفكك الغشاء النووي ، الغشاء ذو الطبقات المزدوجة المحيط بالنواة ، وينتقل الحمض النووي البلازميد إلى النواة.
قم بتقطيع الخلايا الكهربائية إلى آبار تحتوي على وسائط من صفيحة متعددة الآبار مع أغطية مغلفة بالبروتين. احتضن للسماح للخلايا بالالتصاق بالغطاء المغطى بالبروتين. تعبر الخلايا المنقولة بنجاح التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد عن البروتينات الفلورية.
للبدء ، أضف 0.5 مل من وسط الاستزراع إلى كل جدار من لوحة الاستزراع المكونة من 24 بئرا التي تحتوي على أغطية مغلفة ، واحتفظ بها دافئة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. ماصة العدد المطلوب من الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مليلتر وتدور عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من Opti-MEM. كرر هذا الإجراء مرتين للتأكد من عدم وجود وسط ثقافة متبقي في الأنبوب. اضبط معلمات التثقيب الكهربائي كما هو مذكور. قم بعمل ماصة تفاعل التثقيب الكهربائي برفق لخلط جيدا، واستخدم طرف ماصة P200 طويل لنقل حجم دقيق يبلغ 100 ميكرولتر من الخليط إلى كوفيت الفجوة بملليمترين.
بمجرد أن تصبح الكوفيت داخل حجرة الكوفيت ، اضغط على زر أوميغا الخاص بجهاز الثقب الكهربائي ، ولاحظ قيمة المعاوقة من خلال الالتزام بحجم دقيق يبلغ 100 ميكرولتر. يجب أن يكون نطاق قيم المعاوقة حوالي 30 و 35.
اضغط على زر البدء لبدء النبض. سجل القيم الحالية المقاسة والمجوهرات المعروضة على إطار القراءة. أخرج الكوفيت من الغرفة.
أضف على الفور 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الدافئ مسبقا إلى الكوفيت ، وأعد تعليقه عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات. انقل تعليق الخلية على الفور إلى اللوحة المكونة من 24 بئرا المعدة مسبقا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.