نوة أشكال الطفيليات: طريقة تعداء قائمة على التثقيب الكهربائي لتوصيل بلازميدات ترميز البروتين الفلوري إلى نواة البوغية

لتوصيل البلازميدات إلى نوى البوغات عن طريق النواة ، ابدأ بتعليق البوغات المعزولة والقابلة للحياة - المرحلة المتحركة والمعدية من الطفيليات - في العازلة. Sporozoites عبارة عن خلايا نحيلة الشكل محاطة بغشاء بلازما خارجي ومركب غشاء داخلي أساسي يتكون من سلسلة من الحويصلات والبروتينات المسطحة الحاسمة للاستقرار الهيكلي والحركة.

الطرد المركزي التعليق لتكوير البوغ. أعد تعليق حبيبات البوغية في حجم مناسب من المخزن المؤقت للتعداء النووي ، مع استكمال البلازميدات المشفرة للبروتين الفلوري. يضمن المخزن المؤقت للتعداء النووي بقدرة التخزين المؤقت العالية والقوة الأيونية تعداء فعالا مع الحفاظ على وظيفة البوغ

.

انقل المعلق إلى كوفيت الإرسال النووي. ضع الكوفيت في حامل جهاز النواة. قم بتشغيل برنامج النواة المناسب.

أثناء النواة ، يتم تطبيقها على وجه التحديد ، فإن النبضات القصيرة عالية الجهد ، جنبا إلى جنب مع المكونات العازلة ، تعطل مؤقتا غشاء البلازما ومركب الغشاء الداخلي ، وتشكل مسام الغشاء ، والتي توفر وصول البلازميدات إلى السيتوبلازم.

في الوقت نفسه ، تزعج هذه المجالات الكهربائية عالية القوة أيضا الغشاء النووي مزدوج الطبقات المحيط بالنواة التي تطور فجوات عابرة ، مما يسهل الدخول المباشر للبلازميدات إلى النواة ، دون الحاجة إلى انقسام الخلية.

بمجرد اكتمال النواة ، يتم إعادة إغلاق مسام الغشاء الخلوي والنووي ، واستعادة سلامة الغشاء والتوازن أثناء حبس البلازميدات داخل النواة.

قم بإزالة الكوفيت من الجهاز. أضف وسائط مناسبة لاستعادة البوغات ونقلها إلى أنبوب جديد. نجح نوويكتيبت البوغية مع الحمض النووي البلازميد عن البروتينات الفلورية.

أولا ، قم بالطرد المركزي لتعليق sporozoites أو merozoites عند 600 × جم لمدة 10 دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية. بالترتيب التالي ، أضف 85 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتعداء النووي ، و 10 ميكروغرام من البلازميد ، و 25 وحدة من إنزيم التقييد في أنبوب 1.5 مليلتر يحتوي على sporozoites أو merozoites. انقل المعلق إلى كوب تعداء نووي.

ضع الكوب في أخدود نقل نووي ، وقم بتشغيل جهاز النواة باستخدام زر الطاقة ، وحدد إجراء التعداء U-033. عند انتهاء البرنامج ، اضغط على الزر X الخاص بجهاز nucleofection ، وستعرض الشاشة موافق ، مما يشير إلى نجاح النواة. أضف 0.5 إلى 1 مليلتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco إلى كوب النواة لإيقاف التفاعل.

بعد الخلط برفق ، انقل التعليق إلى أنبوب سعة 1.5 مل.