نقل الجينات بوساطة بيولوجية: تقنية لتوصيل الجين ذي الأهمية في الخلايا المستهدفة عبر مسدس جيني بيولوجي

ابدأ بالحجم الأمثل من حبات الذهب - مركبات توصيل الجينات الخاملة بيولوجيا وغير السامة - في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثم أضف العوامل الموجبة - سبيرميدين وكلوريد الكالسيوم ، متبوعة بشظايا الحمض النووي المرغوبة إلى حبات الذهب. نفض الغبار برفق على الأنبوب واحتضانه.

يرتبط كلوريد الكالسيوم بشظايا الحمض النووي ويسهل طلاءها على حبات الذهب عبر بقايا سبيرميدين. بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي وإزالة المذيب. أعد تعليق الخرز المطلي بالحمض النووي في الإيثانول. قم بتقطيع الخرزات برفق على قرص حامل كبير معقم. دعها تجف.

قم بإعداد جهاز مسدس جيني بيولوجي يتألف من أنبوب تسريع غاز الهيليوم وغرفة قصف مع قرص تمزق وشاشة توقف في الفتحات الخاصة بهما. بعد ذلك ، قم بعكس قرص الناقل الكبير وتحميله أسفل قرص التمزق.

بعد ذلك ، ضع الخلايا المضيفة المستهدفة المستزرعة في وسط صلب مناسب مكمل بالسوربيتول - مثبت تناضحي لتحسين كفاءة التحول. بمجرد أن يصبح الإعداد جاهزا ، أطلق مسدس الجينات.

عندما ينتقل الهيليوم إلى أسفل أنبوب التسارع ، يستمر الضغط في التراكم حتى ينكسر قرص التمزق ، مما يؤدي إلى موجات صدمة الهيليوم. تدفع موجات الصدمة هذه قرص الناقل الكبير الذي يحمل حبات ذهبية نحو شاشة التوقف ، مما يسمح فقط للحبات الذهبية بالمرور.

تخترق الخرزات الذهبية المتسارعة نواة الخلية المضيفة ، وتدمج الحمض النووي المطلوب في جينوم الخلية المضيفة.

ابدأ باستخدام الملقط لغمر الأقراص البيولوجية البرتقالية الكبيرة في الإيثانول بنسبة 100٪ ، ثم انقل الأقراص إلى طبق بتري كبير يحتوي على المجفف ، مع الحرص على ألا تلمس الأقراص المجففة. بمجرد أن تجف ، اضغط على الأقراص في حاملات الأقراص الفضية الممسحة بالإيثانول ، ثم قم بتدوير أنبوب من الخرز الذهبي ، وقم بتحويل 12 ميكرولترا من محلول الخرزة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر لكل تحويل.

بعد ذلك ، أضف بالتتابع 2 ميكروغرام من الحمض النووي ، و 10 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم ، وميكرولترين من القاعدة الخالية من السبميدين في كل أنبوب من الخرز. دوامة كل عينة بعد ذلك ، احتضن الأنابيب في درجة الحرارة المحيطة لمدة 5 دقائق ، مع نقر لطيف من حين لآخر لإعادة تعليق الخرز المستقر.

في نهاية الحضانة ، قم بتقطيع حبات الذهب المطلية بالحمض النووي ، واستنشق المادة الطافية بعناية. قم بتعليق الخرزات ببطء تماما في 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ ، ثم قم بتقطيع الخلايا مرة أخرى ، وهذه المرة قم بتعليق الخرزات في 8 ميكرولتر من الإيثانول.

الآن قم بتوزيع كل أنبوب من الخرز على مركز قرص بيولوجي فردي في دوائر قطرها 1 سم. في حالة وجود تركيز كاف من الخرزات ، ستظهر دائرة ذهبية في وسط كل قرص بمجرد جفاف الخرز.

لتشغيل مسدس الجينات ، قم أولا بتشغيل مضخة التفريغ ، ثم أدر مقبض خزان الهيليوم عكس اتجاه عقارب الساعة حتى يتم الوصول إلى ضغط يبلغ حوالي 2200 رطل لكل بوصة مربعة على مقياس الضغط. بعد ذلك ، اقلب المفتاح الأحمر الأيسر لتشغيل مسدس الجينات ، واضبط معدلات تدفق الفراغ والتنفيس بحيث يصل الفراغ إلى 28 بوصة من الزئبق في غضون 15 ثانية. تأكد من أن المسافة بين قرص التمزق والناقل الكلي تبلغ حوالي 3/8 من البوصة في هذا الوقت أيضا.

عندما يكون كل شيء في موضعه ، امسح الغرفة بأكملها بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واغمر أقراص التمزق في 100٪ من الإيثانول. بعد تجفيف الأقراص على سطح معقم ، استخدم مفتاح عزم الدوران لفك حامل قرص التمزق ، وأدخل قرصا نظيفا. قم بربط حامل قرص التمزق مرة أخرى في مكانه ، وقم بتدويره مرة واحدة إلى اليمين باستخدام مفتاح عزم الدوران لإحكام ربطه.

بعد ذلك ، اغمر الشاشات الشبكية في 100٪ من الإيثانول. بمجرد أن يجف ، ضع حاجزا على لوحة التثبيت البلاستيكية البيضاء ، وضع حامل قرص الناقل الكبير ، جانب الحمض النووي لأسفل ، في حجرة القرص. قم بربط الغطاء الفضي وضع لوحة التثبيت في الفتحة العلوية ، ثم ضع لوحة أجار YPD التي تحتوي على 1 سوربيتول مولار على اللوحة السفلية.

الآن أغلق باب الغرفة وأغلقه في مكانه ، ثم ادفع المفتاح الأحمر الأوسط مع الاستمرار في الوضع العلوي لإشراك الفراغ ، والسماح له بالوصول إلى 28 بوصة من الزئبق. بمجرد الوصول إلى مستوى الفراغ المناسب ، ونقل المفتاح الأوسط إلى الوضع السفلي ، اضغط باستمرار على المفتاح الأحمر الأيمن لإطلاق النار.

عندما ينبثق قرص التمزق ، حرر زر إطلاق النار على الفور وادفع المفتاح الأحمر الأوسط إلى الموضع الأوسط من أجل تنفيس الغرفة إلى 0 رطل لكل بوصة مربعة. إذا نجحت اللقطة ، فسيظهر خاتم ذهبي على اللوحة. قم بتنظيف قرص التمزق وحطام قرص الناقل الكبير ، وقم بإيقاف تشغيل مسدس الجينات ، ثم قم بتدوير مقبض خزان الهيليوم في اتجاه عقارب الساعة لإيقاف تشغيل الغاز وإيقاف تشغيل مضخة التفريغ.