JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 2:44 د • July 8th, 2025
التنكس الدهني الكبدي هو حالة مرضية تتميز بالتراكم المفرط للدهون في خلايا الكبد - وهو نوع بارز من خلايا الكبد. تترسب الدهون على شكل قطرات دهنية بأحجام مختلفة في سيتوبلازم خلايا الكبد.
من الناحية الهيكلية ، تحتوي قطرة الدهون على نواة من الدهون المحايدة الكارهة للماء مثل الدهون الثلاثية واسترات الكوليسترول. اللب محاط بطبقة أحادية الفوسفوليبيد مزينة ببروتينات مختلفة.
لتصور ترسب الدهون ، خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على ثقافة خلايا كبد ملتصقة. تتم معالجة الخلايا مسبقا بوسط شوخ دهني للحث على تراكم قطرات الدهون بداخلها.
أضف التركيز المطلوب من بارافورمالدهايد ، الذي ينتشر في الخلايا ، ويربط البروتينات. تعمل هذه الخطوة على تعطيل البروتياز والحفاظ على بنية خلايا الكبد. تخلص من البارافورمالدهيد وأضف محلول Oil-red-O الذي يحتوي على الصبغة العضوية المذابة في الأيزوبروبانول.
يعمل الأيزوبروبانول كمذيب ناقل لجزيئات الزيت الأحمر القابلة للذوبان بشكل ضئيل. يساعد هذا جزيئات الصبغة على دخول خلايا الكبد الثابتة والوصول في النهاية إلى قطرات الدهون. بمجرد دخولها ، تنتقل الصبغة من الأيزوبروبانول إلى الدهون المحايدة بسبب تقاربها العالي ، وتشكل مركب صبغة الدهون. ينتج عن هذا اللون الأحمر لقطرات الدهون.
تخلص من الصبغة الزائدة وراقب الخلايا تحت المجهر. تظهر قطرات الدهون داخل الخلايا باللون الأحمر بشكل مكثف.
ضع غطاء لزراعة الخلايا في كل بئر في صفيحة مكونة من 24 بئرا ، وقم بزرع خلايا HepG2 ، كما هو موضح في المخطوطة النصية. بعد الحضانة المناسبة ، اغسل الخلايا ب 1 مليلتر من PBS ، وتخلص من المادة الطافية. قم بإصلاحها باستخدام 1 مليلتر من 4٪ بارافورمالدهايد في PBS ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من البارافورمالدهيد الزائد ، واشطف الخلايا ب 1 ملليلتر من الماء المقطر.
ثم أضف 1 مليلتر من الأيزوبروبانول بنسبة 70٪ ، واحتضنه لمدة 5 دقائق. تخلص من الأيزوبروبانول الزائد ، وأضف 1 مليلتر من محلول Oil-red O ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة. تخلص من محلول O الأحمر الزيتي الزائد ، ثم اشطفه ب 1 ملليلتر من الماء المقطر. راقب الخلايا تحت المجهر بتكبير 400x.