JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 3:32 د • July 8th, 2025
الطحالب هي كائنات حية مائية لعملية التمثيل الضوئي تنتج مجموعة متنوعة من الدهون ، والتي تعتبر الدهون المحايدة ضرورية لإنتاج وقود الديزل الحيوي.
لاكتشاف الدهون المحايدة وتحديدها كميا ، امزج الحجم الأمثل من تعليق الطحالب والإيثانول في صفيحة ميكروتيتر سوداء جيدا. يصبح جدار الخلية الطحالبية وغشاءها ، اللذان يمنعان معظم البقع من الاختراق ، قابلين للاختراق عند تعرضهما للإيثانول. بعد ذلك ، امزج الإيثانول مع صبغة الفلورسنت القابلة للذوبان في الدهون - أحمر النيل. أضف هذا الخليط إلى البئر المحتوي على الطحالب.
ضع لوحة الميكروتيتر في مقياس الطيف الضوئي. ضع برنامجا يضمن الحضانة مع الاهتزاز المتقطع لتسهيل التفاعل بين الصبغة والطحالب.
نظرا لأن النيل الأحمر كاره للماء ، فلا يمكنه اجتياز السيتوبلازم بسهولة. المذيبات مثل الإيثانول ، عندما تقترن بأحمر النيل ، تحشد الصبغة وتساعدها على الوصول إلى الأجسام الدهنية المنتشرة في السيتوبلازم. ثم يخترق النيل الأحمر الأجسام الدهنية ويذوب هناك ، وبالتالي يلطخ الدهون.
تظهر الخلايا التي تعاني من نقص الدهون على شكل حلقات فلورية ذات أجسام داكنة ، بينما تظهر الخلايا الغنية بالدهون توهجا برتقاليا أحمر ساطعا حيث تتراكم الأجسام الدهنية.
بعد تلطيخ الخلايا ، قم بتعريضها لطول موجي يثير الدهون المحايدة إلى أقصى حد. سجل التألق الناتج وربطه بمنحنى المعايرة لتحديد الدهون المحايدة في عينات الاختبار.
من أجل القياس الكمي الفلوري ، قم بإعداد جميع عينات الطحالب بنفس تركيز الكتلة الحيوية ، وبنفس الطريقة ، مثل المعايير المستخدمة في القياس. افعل ذلك عن طريق تعليق العينات المجففة مسبقا في الكمية المناسبة من محلول الفوسفات. إذا لزم الأمر ، استخدم الخالط لتسهيل إعادة تعليق خلايا الطحالب المجففة.
لكل عينة ، اخلطي 80 ميكرولترا من محلول الإيثانول المحضر بنسبة 30٪ ، و 10 ميكرولترات من محلول أحمر النيل المحضر ، و 10 ميكرولترات من تعليق الطحالب ، في بئر واحد من صفيحة 96 بئرا. من أجل حساب تباين قياس التألق بشكل صحيح ، قم بإجراء خمس تكرارات لكل عينة. بعد ذلك ، قم بتشغيل منحنى معايرة من نقطتين مع المعايير المعدة مسبقا ، من أجل حساب الاختلافات اليومية في الأداة والتحضير.
لإجراء قياسات التألق في مقياس الطيف الضوئي لقارئ الألواح متعدد الآبار ، اضبط المعلمات على الاهتزاز عند 1,200 دورة في الدقيقة والدوران 3 ملليمترات لمدة 30 ثانية ، تليها الحضانة عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. هزة أخرى عند 1,200 دورة في الدقيقة ، وتدور 3 ملليمترات لمدة 30 ثانية ، ولتسجيل التألق ، مع الإثارة عند 530 نانومتر وانبعاث عند 604 نانومتر. ثم ابدأ الجري. كخطوة أخيرة ، قم بتحويل قياسات التألق إلى محتوى الزيت باستخدام نتائج المعايير الداخلية.