تلطيخ فون كوسا لخلايا العضلات الملساء الوعائية الأبهري: تقنية في المختبر لتقييم تكلس الطبقة الإنسية الشريانية

خلايا العضلات الملساء الوعائية ، أو VSMCs ، هي المكونات الخلوية البارزة في وسط الغلالة - الطبقة الوسطى من جدار الأوعية الدموية. استجابة للإشارات المرضية أو الشيخوخة ، تتوسط هذه الخلايا تكلس الأوعية الدموية - وهي ظاهرة تراكم الكالسيوم في المصفوفة خارج الخلية.

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على طبقة ملتصقة من ثقافة VSMC الأبهري الفئران المتكلسة مسبقا. احتضان الخلايا بمحلول الفورمالين لربط البروتينات الخلوية ، وتثبيت بنية VSMC قبل تلطيخها.

ابدأ تلطيخ فون كوسا عن طريق شفط الفورمالين من البئر وإضافة محلول نترات الفضة. احتضان اللوحة تحت مصدر ضوء مناسب.

بمجرد وصول محلول نترات الفضة إلى مواقع التكلس في المصفوفة خارج الخلية لطبقة VSMC ، تحل أيونات الفضة محل أيونات الكالسيوم المرتبطة بالفوسفات. ينتج عن هذا لون أصفر عابر. في وجود المواد العضوية والضوء ، يؤدي التحلل الكيميائي الضوئي لفوسفات الفضة إلى تكوين فضة معدنية سوداء اللون.

تخلص من الحد الأقصى لكمية محلول نترات الفضة المستهلكة. عالج الخلايا بمحلول ثيوسلفات الصوديوم. يحول هذا المحلول أملاح الفضة المتبقية إلى مركب قابل للذوبان في الماء ، والذي يمكن إزالته عن طريق الشطف النهائي بالماء ، مما يحسن تباين التلوين.

قم بتصوير الخلايا الملطخة لتحديد موقع الرواسب السوداء غير القابلة للذوبان التي تشير إلى التكلس.

للحث على التكلس في خلايا العضلات الملساء الوعائية ، انقل الخلايا إلى صفيحة الثقافة ذات الآبار الستة ، واتركها بالالتصاق. بعد ذلك ، أعد تغذية الخلايا في وسائط التكلس. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام على الأقل. بعد ذلك ، استنشق الوسائط من لوحة زراعة الخلية. اغسل الخلايا مرة واحدة في الماء منزوع الأيونات.

قم بإصلاح الخلايا عن طريق وضعها في 1 مليلتر من الفورمالين بنسبة 10٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم قم بإزالة الفورمالين وغسل الخلايا الثابتة بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.

بعد ذلك ، احتضن الخلايا في 1 مليلتر من محلول نترات الفضة بنسبة 5٪ تحت لمبة من 60 إلى 100 واط لمدة 1 إلى 2 ساعة. بعد ذلك ، استنشق محلول نترات الفضة ، واغسله بالماء المقطر لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة الفضة غير المتفاعلة عن طريق وضع الخلايا في 1 مليلتر من محلول ثيوسلفات الصوديوم 5٪ في الماء المقطر لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، اشطف الخلايا بالماء المقطر لمدة 5 دقائق. الخلايا الملطخة بفون كوسا جاهزة الآن للتصوير باستخدام الفحص المجهري الضوئي المقلوب القياسي.