موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 3:50 دقيقة • July 8th, 2025
للتلوين السلبي للفيروسات المغلفة ، ابدأ بالتعليق الفيروسي المطلوب. احتضان الفيروسات باستخدام الجلوتارالديهايد ، وهو مثبت كيميائي. عند الاختراق ، يربط الجلوتارالديهايد البروتينات الفيروسية والأحماض النووية ، مما يؤدي إلى تعطيل الفيروسات مع الحفاظ على التشكل ، وبالتالي تسهيل التعامل الآمن مع الفيروسات. انقل هذا الخليط إلى طبق متعدد الآبار.
قم بإرفاق المجهر الإلكتروني للإرسال ، TEM ، الشبكات التي تحتوي على كبسولة بماصة عبر قارنة. باستخدام الماصة، استنشق الخليط المثبت للفيروسات في الكبسولة. احتضن مجموعة الماصة حتى تمتص الفيروسات على أسطح الشبكة.
انزع الخليط. اغسل الكبسولة وإزالة الفيروسات والمثبتات غير الملتصقة. ماصة محلول من أسيتات اليورانيل ، وهي صبغة معدنية ثقيلة ، في الكبسولة. احتضن لتمكين البقعة من الاتصال بالفيروسات.
ترتبط أيونات اليورانيل ببروتينات سكري غشائية معينة وفوسفوليبيدات على الأسطح الفيروسية. يمكن للأيونات اختراق الفيروسات والارتباط ببروتينات النوكليوكابسيد التي تحيط بالجينوم. يؤدي هذا الارتباط إلى تراكم أيونات المعادن الثقيلة وترسب حول الفيروس والهياكل الفيروسية المحددة.
افصل الكبسولة. قم بإزالة البقع الزائدة من الشبكات وجففها في الهواء.
أثناء التصوير TEM ، تعبر حزم الإلكترون عالية الطاقة الفيروس ، مما يتسبب في تشتت المناطق الملطخة بالإلكترونات الكثيفة بالإلكترونات في الفيروس. ومع ذلك ، فإن كثافة الإلكترون المنخفضة الإجمالية للفيروس تسمح للإلكترونات بالعبور. يعالج نظام التصوير هذه الإلكترونات المتناثرة بشكل مختلف ، مما ينتج عنه صورة عالية التباين.
تظهر الفيروسات ذات الصبغة السلبية أفتح مع نوكليوكابسيد داكن على حدود داكنة ، مما يسهل تصور البنية الفوقية.
للبدء ، امزج معلق الفيروس بحجم متساو من 4٪ جلوتارالديهايد لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 2٪ جلوتارالديهايد. باستخدام المثبت ، قم بتعطيل الفيروس لمدة 24 ساعة على الأقل. قم بتطهير الأنبوب ونقله إلى منشأة BSL2-EM.
بعد ذلك ، قم بتوصيل التقاط محمل بالشبكة بماصة. استنشق الخليط في الكبسولة. ضع الماصة على جانبها مع توجيه الشبكات أفقيا لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك ، التقط الماصة ، وطرد خليط الفيروسات في حاوية نفايات. استنشق 40 ميكرولترا من الماء منزوع الأيونات في الكبسولة ، ثم تخلص من الماء في حاوية النفايات. كرر هذا الغسيل ثلاث مرات.
بعد ذلك ، قم بشفط 40 ميكرولترا من 1٪ UA أو 1٪ PTA في الكبسولة لمدة 30 ثانية. قم بإزالة الكبسولة من الماصة. باستخدام ورق الترشيح ، جفف الشبكات ، ثم اترك الشبكات تجف في الهواء.