JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 3:14 د • July 8th, 2025
بالنسبة للتلطيخ الخاص بالسيتوبلازم في البيئات الدقيقة للأنسجة الرخوة ، احصل على كلية فأر محصودة حديثا. عالجها بمحلول مثبت يحتوي على الفورمالديهايد وحمض الخليك الجليدي والميثانول. احتضان في درجات حرارة منخفضة.
يخترق الفورمالديهايد الخلايا ، ويربط البروتينات بالبروتينات والبروتينات بالأحماض النووية. يزيح الميثانول الماء من الأنسجة ويتخثر البروتينات. يسبب حمض الخليك التحمض داخل الخلايا وتورم الأنسجة ، وبالتالي يقاوم انكماش الأنسجة الناجم عن الميثانول.
يعملالتثبيت على تعطيل الإنزيمات واستقرار مورفولوجيا الأنسجة للتلوين اللاحق. قم بإزالة المثبتات الزائدة باستخدام المخزن المؤقت. احتضان الأنسجة باستخدام اليوزين Y ، وهي صبغة حمضية.
يخترق الإيوسين الخلايا الثابتة ويدخل السيتوبلازم. تتسبب البيئة الحمضية للسيتوبلازم ، من معالجة حمض الخليك ، في أقصى قدر من البروتونات للمجموعات الأمينية للبروتينات السيتوبلازمية.
يتفاعل الإيوزين ، مع المجموعات الوظيفية سالبة الشحنة ، إلكتروستاتيكيا مع مجموعات البروتونات البروتونية ، مكونا مركبا مستقرا للصبغة البروتينية ، ويلطخ السيتوبلازم باللون الوردي عند التراكم. بعد الحضانة ، قم بتقطيع الكلى الملطخة إلى قطع صغيرة ، متبوعة بجفاف الأنسجة في زيادة تركيزات الإيثانول.
قم بتضمين أنسجة الكلى في شمع البارافين. احصل على أقسام رقيقة من الأنسجة باستخدام ميكروتوم. علاوة على ذلك ، أعد ترطيب الأقسام للتحليل المجهري.
تظهر نوى الخلايا غير الملوثة باللون الأبيض مقابل السيتوبلازم الملون باللون الوردي ، مما يتيح تصور الهياكل المجهرية للكلى مثل الأنابيب الملتوية القريبة ، والتي تشتمل على خلايا ظهارية ذات حدود فرشاة ، أو قنوات تجمع ، مبطنة بخلايا ظهارية مسطحة بدون حدود فرشاة.
ابدأ بتثبيت عينات الأنسجة الرخوة. املأ أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر بمحلول مثبت يحتوي على 9.5 مل من الفورمالديهايد 4٪ و 0.5 مل من حمض الخليك الجليدي. أضف عينة الأنسجة الرخوة إلى أنبوب الطرد المركزي ، وضعها في الثلاجة لمدة 24 إلى 72 ساعة.
بعد التبريد ، اغسل عينة الأنسجة الرخوة بمحلول DPBS لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، قم بتلطيخ العينة عن طريق وضعها في 2 مل من محلول تلطيخ الإيوزين Y ، واحتضانها على لوحة اهتزاز أفقية لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي ، أخرج عينة الأنسجة الرخوة بعناية من حاوية العينة وقم بإزالة عامل التلوين الزائد باستخدام مناديل السليلوز. ضعه في وعاء مخروطي فوق مرحلة بخار الإيثانول للتخزين والاستخدام الإضافي.