تلطيخ الميثيلين الأزرق لتقييم تكوين مستعمرة نقيلية في المختبر: إجراء تلطيخ لتقييم ورم خبيث عن طريق تحديد الخلايا السرطانية المحصودة من نموذج الفأر السرطاني

أثناء ورم خبيث للسرطان ، تنتقل الخلايا السرطانية من الورم الأولي عبر الدورة الدموية ، وتتسرب إلى الأعضاء البعيدة ، وتؤسس أورام ثانوية.

لتقييم ورم خبيث في الرئة في نموذج فأر سرطان الثدي الذي تم حقنه بخلايا 4T1 ، وخلايا سرطان الثدي شديدة النقيلية ، قم بإعداد تعليق خلوي ، بما في ذلك خلايا 4T1 ، معزولة من الرئتين المحصودة. الطرد المركزي التعليق وإعادة تعليق الخلايا في الوسائط التي تحتوي على 6-thioguanine ، 6-TG - نظير الجوانين. بذر معلق الخلية في لوحة ثقافة.

يدخل 6TG إلى الخلايا الطبيعية حيث يقوم إنزيم ترانسفيراز معين بتحويله إلى نيوكليوتيدات 6-TG ، وهي نيوكليوتيدات سامة. يتم دمج هذه النيوكليوتيدات السامة للخلايا في الحمض النووي ، مما يتسبب في تلف الحمض النووي ، والقضاء بشكل انتقائي على الخلايا من المزرعة. قللت خلايا 4T1 من قدرتها على تكوين نيوكليوتيدات سامة ، مما يسهل بقائها على قيد الحياة والتمسك باللوحة. اعتمادا على قدرة الخلايا على التكاثر ، فإنها تشكل مستعمرات.

عالج الخلايا بالميثانول. يتخلل الميثانول الخلايا ويفسد البروتينات الخلوية. احتضان الخلايا بالميثيلين الأزرق.

تدخل

الصبغة موجبة الشحنة إلى الخلية ، وتتفاعل مع الحمض النووي سالب الشحنة ، وتداخل في الفراغات بين أزواج القواعد المجاورة لخيوط الحمض النووي. كما أنه يرتبط بالحمض النووي الريبي في السيتوبلازم ، ولكن مع تقارب أقل. تلطخ النوى باللون الأزرق الداكن بسبب ارتفاع تركيز الحمض النووي مقارنة بالسيتوبلازم بسبب انخفاض تركيز الحمض النووي الريبي. تظهر المستعمرات النقيلية على شكل نقاط زرقاء.

صور اللوحة. استخدم برنامجا لتحديد المستعمرات النقيلية ، وتحديد العبء النقيلي في رئتي الفأر.

ارفع حجم الأنبوب إلى 10 ملليلتر باستخدام 1X HBSS. بعد ذلك ، اسكب المحتويات فوق مصفاة خلية 70 ميكرومتر في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل. استخدم مكبس حقنة سعة 1 مليلتر لطحن العينة برفق من خلال المصفاة.

قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 5 دقائق عند 350 مرة جم ، وتخلص من المادة الطافية. ثم اغسل الحبيبات مرتين ب 10 ملليلتر من 1X HBSS. أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من 60 ميكروموريال 6-ثيوجوانين وسائط استزراع كاملة ، وقم بوضع العينات في ألواح زراعة الخلايا التي يبلغ طولها 10 سم باستخدام مخطط التخفيف ، إذا رغبت في ذلك.

احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 5 أيام. صب وسائط الاستزراع من الأطباق في حاوية النفايات المناسبة. لإصلاح الخلايا ، أضف 5 ملليلتر من الميثانول غير المخفف إلى كل طبق ، واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، مع التأكد من تحريك الميثانول بحيث يغطي اللوحة بأكملها.

صب الميثانول من الألواح في حاوية النفايات المناسبة ، ثم اشطف كل طبق ب 5 مل من الماء المقطر. أضف 5 ملليلتر من 0.03٪ من الميثيلين الأزرق لكل طبق ، واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، مع التأكد من تحريك محلول الميثيلين الأزرق بحيث يغطي اللوحة بأكملها. صب الميثيلين الأزرق في حاوية النفايات المناسبة ، واشطف كل طبق مرة أخرى ب 5 مل من الماء المقطر.

اقلب الطبق رأسا على عقب وامسحه بمنشفة ورقية لإزالة السوائل الزائدة. ضع الطبق على غطاءه واتركه يجف في الهواء طوال الليل. ستكون المستعمرات النقيلية زرقاء. بمجرد أن تجف الأطباق ، يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى.