تلطيخ الفضة الفلورية: تقنية لتصور البروتين الكلي في المواد الهلامية بولي أكريلاميد

تلطيخ الفضة الفلورية للبروتينات في المواد الهلامية متعددة الأكريلاميد مجسات الفلورية لاكتشاف البروتينات وتحديدها.

ابدأ بهلام بولي أكريلاميد مع البروتينات ، مفصولة إلى نطاقات من خلال الرحلان الكهربائي. انقع في خليط مثبت من الإيثانول وحمض الأسيتيك ، مما يمنع العصابات من الانتشار عن طريق تغيير طبيعة البروتينات.

اغسل الجل لإزالة بقايا حمض الأسيتيك والإيثانول. اغمر الجل في وصمة عار نترات الفضة. ترتبط أيونات الفضة بقوة بالمجموعات سالبة الشحنة في البروتينات.

احتضن في الظلام. اشطف الجل بالماء فائق النقاء لإزالة المجمعات الأيونية الفضية غير المربوطة.

اغمر الجل في محلول متطور يحتوي على مسبار فلوروجيني متعدد المكونات - TPE-4TA. يستهدف هذا المسبار الأنيوني أيونات الفضة المرتبطة بالبروتين ، مكونا مجاميع غير قابلة للذوبان تنشط الخصائص الفلورية للمسبار ، وبالتالي تضفي الفلورة.

نظرا لأن تنشيط التألق يعتمد على التجميع ، فإن المجسات غير المنضمة لا تصدر أي إشارة ، مما يتيح تلطيخ البروتين الكلي مع انخفاض انبعاث الخلفية.

احتضن الجل في الظلام مع تحريض لطيف ، مما يضمن تطورا كاملا للفلوروجينيك. انقل الجل في مخزن مؤقت لإزالة المجسات غير المقيدة. أخيرا ، قم بتصوير الجل للحصول على شدة إشارة النطاق. ارسم شدة إشارة التألق مقابل منحنى البروتين القياسي لحساب الكمية الإجمالية للبروتينات في العينة.

بعد الرحلان الكهربائي ، اغمر الجل في محلول سعة 100 مل يحتوي على الإيثانول وحمض الأسيتيك على شاكر مداري ، واحتضانه مرتين لمدة 30 دقيقة لكل منهما ، في درجة حرارة الغرفة أثناء الاهتزاز عند 50 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، اغسل الجل ثلاث مرات بالماء عالي النقاء في وعاء نظيف ، مع كل غسل لمدة 10 دقائق.

أولا ، قم بإذابة 0.01 جرام من نترات الفضة في 10 مل من الماء عالي النقاء لتحضير محلول مرق بتركيز 0.1٪. أضف 100 ميكرولتر من محلول المرق هذا إلى 100 مل من الماء عالي النقاء لصنع محلول عمل نترات الفضة. في غطاء الدخان ، اغمر الجل في 100 مل من محلول عمل نترات الفضة في غرفة زجاجية محكمة الغلق.

استخدم رقائق الألومنيوم لحماية الجل من الضوء أثناء التشريب ، واحتضانه لمدة 1 ساعة أثناء الاهتزاز عند 50 دورة في الدقيقة على شاكر مداري. بعد ذلك ، اغسل الجل مرتين بالماء فائق النقاء في وعاء نظيف ، مع كل غسلة باستخدام ما يقرب من 100 مل من الماء وتستمر لمدة 60 ثانية.

من المهم استخدام الماء عالي النقاء لتنظيف الجل بعد خطوة التشريب الفضي لتقليل تلطيخ الخلفية.

أولا ، أضف 50 مل من الماء عالي النقاء إلى 3 ملليغرام من صبغة TPE-4TA. قم بإجراء المحلول لمدة 3 دقائق ، وأضف 5 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم المولار 1 بين كل جلسة صوتنة ، للمساعدة في إذابة الصبغة ، عادة ما تصل إلى ثلاث مرات. بعد ذلك ، تحقق من تألق المحلول تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر للتأكد من ذوبان الصبغة بالكامل. فقط الحلول الضعيفة أو غير المنبعثة تشير إلى الانحلال الكامل.

لتحضير محلول تطوير الفلوروجينيك ، أضف 10 مل من محلول مخزون TPE-4TA إلى 90 مل من الماء عالي النقاء. استخدم مقياس الأس الهيدروجيني للتحقق من درجة الحموضة في المحلول. اضبط المحلول على درجة حموضة بين 7 و 9 ، باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم المخفف أو حمض الخليك ، إذا كان الرقم الهيدروجيني خارج النطاق.

بعد ذلك ، انقل الجل إلى وعاء نظيف وقابل للغلق يحتوي على 100 مل من محلول الفلوروجين النامي ، وتأكد من غمر الجل تماما. أغلق الحاوية وقم بتغطيتها لحمايتها من الضوء. رج الحاوية طوال الليل على شاكر مداري بسرعة 50 دورة في الدقيقة وفي درجة حرارة الغرفة.

انقل الجل إلى وعاء نظيف ، وقم بإزالة البقع في 100 مل من الإيثانول بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة. ثم اشطف الجل بماء فائق النقاء لمدة 5 دقائق. يمكن تصور الجل على مصباح عابر على الطاولة ، أو تصويره على آلة توثيق هلام في قناة 365 نانومتر أو قناة 302 نانومتر.