موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 3:37 دقيقة • July 8th, 2025
ذبابة الفاكهة الخلايا اليرقية هي خلايا متخصصة تلتصق على شكل مجموعات منفصلة على السطح القاعدي للبشرة الجانبية - الطبقة السطحية من الجلد. تشارك هذه الخلايا بشكل أساسي في عملية التمثيل الغذائي للدهون.
أثناء الجوع ، تتراكم هذه الخلايا الزائدة من قطرات الدهون. تتكون كل قطرة من نواة كارهة للماء من الدهون المحايدة ، مثل الدهون الثلاثية ، واسترات الكوليسترول ، محاطة بطبقة أحادية من الدهون الفوسفورية.
لتصور قطرات الدهون ، خذ قسما مشرحا من بشرة يرقات ذبابة الفاكهة مع الخلايا الليفية المرفقة. عالج بمخزن مؤقت للتثبيت يحتوي على بارافورمالدهيد لربط البروتينات الخلوية مثل البروتياز والحفاظ على السلامة الهيكلية للخلايا الكريمة. قم بإزالة المخزن المؤقت للتثبيت. احتضن بصبغة فلورية تعتمد على BODYPY في الظلام لتجنب التبييض الضوئي.
أثناء الحضانة ، تنتشر الصبغة غير القطبية عبر غشاء الخلية للخلايا النبوية وتعبر الطبقة الأحادية المحيطة بقطرات الدهون. تسمح الكراهية للماء لجزيئات الصبغة بحركتها إلى النواة غير القطبية لقطرات الدهون لربط الدهون المحايدة.
قم بتركيب العينة على شريحة ، مع ملامسة الخلايا الغريبة للشريحة المجهرية للحصول على تصور واضح. أغلق العينة باستخدام غطاء وراقب تحت المجهر الفلوري.
عند الإثارة بالضوء الأزرق بطول موجي يبلغ أربعة وثلاثة وتسعين نانومتر ، تنبعث الصبغة من مضان أخضر عند خمسمائة وثلاثة نانومتر. تؤكد بقع الفلورسنت الخضراء وجود قطرات دهونية.
لتلوين قطرات الدهون ، قم باحتضان البشرة المقطعة في مخزن مؤقت للتثبيت ، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار ، متبوعا بإعادة تعليق سريعة في 1 مليلتر من PBS. بعد ذلك ، اغسل العينات بثلاث غسلات لمدة 5 دقائق في 1 مليلتر من PBS لكل غسلة ، لإزالة أي مثبت متبقي.
بعد الغسيل الأخير ، احتضان عينات البشرة باستخدام مسبار مناسب للدهون لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار. أثناء الحضانة ، لف أنابيب العينة بورق الألمنيوم لحماية الأنسجة من الضوء ، واغسل العينات ثلاث مرات في 1 مليلتر من PBS لمدة 10 دقائق لكل غسلة.
لتصوير الخلايا الكريمة ، انقل كل عينة من البشرة إلى 6 ميكرولترات من وسط التركيب على شريحة مجهرية نظيفة. اضبط اتجاه الأنسجة بحيث يلامس السطح الداخلي الذي يحتوي على الخلايا السفلية الجزء السفلي من الشريحة. ضعي غطاء برفق على البشرة ، وأغلقي الحواف بطلاء أظافر شفاف. عندما يجف الملمع ، قم بتصوير العينات على مجهر متحد البؤر بتكبير 63X مع الأطوال الموجية المناسبة للإثارة والانبعاث.