موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 3:08 دقيقة • July 8th, 2025
ناقضات العظام عبارة عن خلايا كبيرة على شكل قبة ومتعددة النوى توجد على سطح العظام. تحتوي هذه الخلايا على العديد من الحبيبات السيتوبلازمية الغنية بحمض الفوسفاتيز المقاوم للطرطرات ، أو TRAP - إنزيم بروتين معدني يفرز من الحدود المكشكشة لناقضات العظم في أنسجة العظام. يهضم هذا الإنزيم المصفوفة خارج الخلية ويذيب البلورات المعدنية ، مما يسهل ارتشاف العظام.
للكشف عن حبيبات TRAP كعلامات كيميائية خلوية لناقضات العظم ، خذ طبقا مزرعيا يحتوي على ناقضات العظم الملتصقة. أضف محلول تلطيخ TRAP إلى الخلايا. يتكون هذا المحلول من الركيزة - مشتق يحتوي على الفوسفات وحمض الطرطريك في مخزن مؤقت مكمل بملح الديازونيوم.
أضف حمض الأسيتيك إلى هذا المحلول للحفاظ على درجة الحموضة الحمضية اللازمة لتلوين TRAP. احتضان الخلايا في الظلام عند درجة حرارة فسيولوجية للحصول على نشاط إنزيم TRAP الأمثل.
يدخل محلول التلوين إلى ناقضات العظم ، حيث يثبط حمض الطرطريك نشاط التحلل المائي لفوسفاتيز حمض الطرطرات الحساس في الخلايا الأخرى.
في الوقت نفسه ، يقوم TRAP بتحلل الركيزة المضافة لإزالة مجموعة الفوسفات. تتزاوج الركيزة المتحللة بملح الديازونيوم من محلول التلوين لتشكيل مركب صبغة غير قابل للذوبان بلون كستنائي اللون. يترسب هذا المركب على شكل حبيبات في مواقع النشاط الأنزيمي.
صور الخلايا تحت المجهر. يؤكد ترسب حبيبات الصبغة المارونية داخل السيتوبلازم وجود ناقضات العظم المحتوية على TRAP في الثقافة.
في هذه الخطوة ، قم بشفط الوسط ، واغسل العينة برفق ثلاث مرات باستخدام 1X PBS. بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا الموجودة في كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من محلول الإصلاح لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
بعد التثبيت ، قم بشفط محلول الإصلاح ، واغسل الخلايا برفق ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات ، المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بشفط الماء منزوع الأيونات ، وأضف 100 ميكرولتر من صبغة TRAP في كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا.
ضع الطبق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، واحمي من الضوء. بعد التلوين ، استنشق بقعة TRAP واغسلها برفق ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، قم بتصوير ناقضات العظم في مجهر مقلوب بتكبير 40X.