تلطيخ الفضة للجليكوزامينوجليكان الكبريت: طريقة تلطيخ لتصور الجليكوزامينوجليكان الكبريتات في المواد الهلامية بولي أكريلاميد

الجليكوزامينوجليكان الكبريتات ، GAGs ، عبارة عن عديد السكاريد الخطي الطويل ، سالب الشحنة ، مع سلاسل وحدة ثنائية السكاريد المتكررة الكبريتات في مواقع مميزة ، موجودة بأطوال متفاوتة.

لتصور GAGs المعزولة ذات الكبريتات ذات الأهمية التي تختلف في طول السلسلة في هلام بولي أكريلاميد بعد الرحلان الكهربائي ، قم بإزالة الجل بعناية من الكاسيت الخاص به. اشطفها بالماء منزوع الأيونات ، وإزالة قطع الجل المرفقة التي قد تتداخل مع تلطيخها.

عالج بمحلول أزرق ألسيان حمضي. في ظل الظروف الحمضية ، يتفاعل اللون الأزرق Alcian ، وهو صبغة كاتيونية متعددة التكافؤ مع ذرة نحاسية في الوسط ، على وجه التحديد مع GAGs ذات الكبريتات سالبة الشحنة عبر التفاعلات الأيونية ، مما يشكل مركبا أزرق عميقا غير قابل للذوبان في الماء.

اغسل الجل بالماء منزوع الأيونات والميثانول ، وقم بإزالة أي بقعة متبقية. احتضان الجل بمحلول نترات الفضة القلوية. في ظل الظروف القلوية ، توفر GAGs الكبريتية المرتبطة باللون الأزرق من Alcian مواقع لأيونات الفضة موجبة الشحنة للارتباط وتشكيل معقد.

عالج الجل في محلول نامي يحتوي على الفورمالديهايد وحمض الستريك. يخفض حامض الستريك درجة الحموضة المحلية للحصول على النشاط الأمثل للفورمالديهايد ، مما يقلل من أيونات الفضة إلى الفضة المعدنية غير القابلة للذوبان داخل شظايا GAG الكبريتية ، مما يؤدي إلى تضخيم إشارة Alcian الزرقاء.

أضف محلول توقف لخفض درجة الحموضة ، مما يمنع تقليل أيونات الفضة للحد الأدنى من تلطيخ الخلفية. الآن ، تخيل الجل.

تظهر نطاقات شظايا GAG الملونة باللونين الأزرق والفضي من Alcian بنية داكنة أو سوداء ، مما يتيح التصور عالي الحساسية وتحديد أطوال سلسلة بوليمر GAG المعزولة.

بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بتفكيك الكاسيت ، واستخرج الجل بعناية في وعاء كبير ونظيف مملوء بالماء منزوع الأيونات والمفلتر. بعد ذلك ، تخلص من الماء وصمة عار الجل في محلول تلطيخ ألسيان الأزرق لمدة خمس دقائق. تخلص من بقعة ألسيان الزرقاء ، واغسلها بسرعة مرتين إلى ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات والمفلتر حتى تتم إزالة معظم محلول تلطيخ ألسيان الأزرق.

تلطخ الجل بمحلول تلطيخ نترات الفضة في وعاء طازج ونظيف لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل مرتين إلى ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما في ماء مفلتر منزوع الأيونات لإزالة محلول تلطيخ الفضة بالكامل. تخلص من الماء وأضف المحلول النامي.

راقب بعناية الجل لظهور العصابات. اعتمادا على جودة البقعة وكتلة العينة المحملة ، يمكن أن يستغرق التطوير من بضع ثوان إلى عدة دقائق. بمجرد أن تظهر العصابات المرغوبة ، تخلص على الفور من المحلول النامي ، واغسل الجل لفترة وجيزة بمحلول التوقف.