موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 2:52 دقيقة • July 8th, 2025
تقيس فحوصات تكوين المستعمرات قدرة الخلايا على النمو في مستعمرات.
أولا ، تعليق الخلايا المشتق من نخاع عظم البذور الذي يتكون من كريات الدم الحمراء والخلايا أحادية النواة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الوسيطة أو الخلايا الجذعية الوسيطة ، في الوسائط على صفيحة مزرعة واحتضانها. تلتصق الخلايا الجذعية الجذعية بقاع اللوحة بينما تظل كريات الدم الحمراء والخلايا أحادية النواة معلقة ويتم التخلص منها.
أضف وسائط جديدة تحتوي على عوامل نمو لدعم بقاء MSC. اعتمادا على إمكاناتها التكاثرية الفردية ، تتكاثر الخلايا الجذعية الجذعية لتشكيل مستعمرات.
بعد ذلك ، عالج المستعمرات بالميثانول. يتخلل الميثانول الخلايا ، ويزيح الماء من البيئة داخل الخلايا ، ويفسد طبيعة البروتينات ، ويحافظ على الهندسة الخلوية.
احتضان المستعمرات الثابتة بمحلول تلطيخ Giemsa - مزيج من منتجات الأكسدة من الميثيلين الأزرق ، في المقام الأول اللازوردي B ، صبغة أساسية ، و eosin Y ، صبغة حمضية. عند الانتشار في الخلايا ، ترتبط ثنائيات اللازورد B الموجبة الشحنة عن طريق الإقحام بالحمض النووي سالب الشحنة في النواة ، مما يضفي بقعة زرقاء.
ثم تتفاعل مونومرات اليوزين Y سالبة الشحنة مع الشحنات الموجبة غير المعادلة على ثنائيات اللازوردية B المرتبطة ، وتشكل "مركب eosin-Y-azure-B" ، مما يؤدي إلى تغيير لون الحمض النووي الملون باللون الأزرق إلى اللون الأرجواني.
في السيتوبلازم الغني بالريبوسوم ، يرتبط اللازورد B بالحمض النووي الريبي سالب الشحنة ، ولكنه يقلل من تغلغل اليوزين Y في الريبوسومات عالية الكثافة ، ويمنع تكوين مركب eosin-Y-azure-B ، مما يؤدي إلى تلطيخ الحمض النووي الريبي الأزرق.
الآن ، اغسل اللوحة بمحلول عازل لإزالة البقع الزائدة وتجفيفها بالهواء. احسب عدد المستعمرات التي تظهر على شكل مجموعات من الخلايا ذات النوى الأرجوانية والسيتوبلازم الأزرق.
لإجراء فحص CFU ، قم بإعداد 10 مل من محلول Giemsa لكل طبق ، باستخدام ماء معقم لتخفيف محلول المرق من 1 إلى 10. قم بإزالة الوسط من طبق زراعة الخلايا ، واستخدم PBS لغسل الخلايا بعناية.
باستخدام الميثانول النقي ، قم بتثبيت الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، ثم تخلص من الميثانول وأضف محلول Giemsa. احتضن في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد الحضانة ، استخدم PBS لغسل الخلايا مرتين. ثم جفف اللوحة بالهواء أولا على منشفة ورقية. مع وجود علامة على الجزء الخلفي من اللوحة ، قم بحساب المستعمرات يدويا.