تنقية البروتين القائم على كروماتوغرافيا النيكل: تقنية لتنقية البروتينات المؤتلفة الموسومة بالبولي هيستيدين من محللة الخلايا البكتيرية

لتنقية البروتين المؤتلف المدمجة مع علامة بولي هيستيدين - سلسلة من بقايا الهيستيدين في نهاية واحدة - من محللة الخلية البكتيرية ، أولا ، قم بتخفيف محللة الخلية لمنع انسداد العمود أثناء التشغيل الكروماتوجرافي.

قم بتجميع عمود تقارب يحتوي على كاتيونات النيكل ثنائية التكافؤ التي تم تجميدها على مصفوفة حبة الاغاروز باستخدام حمض النتريلوتريأسيتيك ، وهو عامل مخلب. يربط حمض النتريلوتري أسيتيك كاتيونات النيكل عبر أربعة مواقع تساهمية منسقة ، بينما يظل موقعان على أيون المعدن متاحين للتفاعلات مع علامات بولي هيستيدين في البروتين محل الاهتمام.

قم بموازنة العمود بمخزن مؤقت مناسب لتحسين الظروف للتفاعلات الفعالة بين البروتين المعدني. قم بتحميل محللة الخلية على العمود.

تشكل البروتينات المؤتلفة ، التي تحمل بقايا الهيستيدين الطرفية التي يمكن الوصول إليها ، روابط تنسيق مع كاتيونات النيكل بسبب التقارب العالي لأيون المعدن مع الإيميدازول ، السلسلة الجانبية للهيستيدين ، وترتبط بالمصفوفة. العدد الكبير من الهيستيدين المتتالي في البروتين المؤتلف يقوي ارتباطه بالمصفوفة.

بالمقارنة ، فإن البروتينات التي تفتقر إلى بقايا الهيستيدين لا تلتصق بالعمود وتتدفق من خلالها. اغسل العمود بمخزن مؤقت إيميدازول منخفض التركيز.

يتنافس إيميدازول مع ملوثات البروتين ضعيفة الارتباط والتي قد تكون قد التزمت بشكل غير محدد بالمصفوفة عبر بق