الكروماتوغرافيا السائلة للتفاعل الماء: تقنية لفصل التحليلات القطبية المحبة للماء باستخدام الخرز المحبة للماء

الكروماتوغرافيا السائلة للتفاعل المحبة للماء ، HILIC ، هي تقنية لفصل المركبات القطبية المحبة للماء بناء على درجة قطبيتها ابدأ بإعداد عمود HILIC مليء بالخرز المحبة للماء الذي يحمل مجموعات وظيفية قطبية.

أولا ، قم بتكييف العمود باستخدام عازلة توازن ومرحلة متحركة - خليط من المذيبات العضوية والماء. تعمل جزيئات المخزن المؤقت على تثبيت الأس الهيدروجيني ، بينما يشبع المذيب العضوي العمود. تجميد جزيئات الماء وتخلق طبقة مائية فوق الخرز المحبة للماء.

قم بتحميل العينة التي تحتوي على خليط من الجليكان - المركبات القطبية المحبة للماء - المسمى بعلامة الفلورسنت. قم بتشغيل العينة باستخدام تدرج طور متحرك عبر العمود بمعدل تدفق مثالي.

عندما تتحرك العينة على طول المرحلة المتنقلة الكارهة للماء ، تهاجر الجليكان إلى الطبقة المائية ، تاركة وراءها الشوائب. بعد ذلك ، تتحرك الجليكان نحو المجموعات الوظيفية القطبية على الخرز. هنا ، ترتبط المزيد من الجليكانات القطبية بقوة ، بينما ترتبط الجليكانات الأقل قطبية بشكل فضفاض.

مع انخفاض الكراهية للماء في المرحلة المتنقلة ، تتخلص الجليكانات ضعيفة الارتباط مع قطبية أقل ووقت احتفاظ أقصر أولا. على العكس من ذلك ، فإن الجليكان المرتبط بقوة مع قطبية أعلى ووقت احتفاظ أطول أخيرا.

أخيرا ، يكتشف الكاشف إشارة الفلورسنت للكسور المملوءة ، المقابلة لقمم الجليكان القياسية في الكروماتوجرام.

أولا ، افتح البرنامج للتحكم في مراحل الهاتف المحمول. اغسل أدوات UPLC بمذيب B بنسبة 50٪ و 50٪ مذيب C بمعدل تدفق 0.2 مل في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل بمذيب 25٪ A و 75٪ مذيب B بمعدل تدفق 0.2 مل في الدقيقة ، لمدة 20 دقيقة ، ثم بمعدل تدفق 0.4 مل في الدقيقة.

قم بإذابة N-glycans المسمى ب 25 ميكرولتر من خليط من الأسيتونيتريل بنسبة 100٪ والماء فائق النقاء بنسبة 2: 1 (الحجم / الحجم). بعد ذلك ، قم بجهاز الطرد المركزي عند 134 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واستخدم أنبوب محرك لتحميل 10 ميكرولتر من المادة الطافية في أدوات UPLC.

افصل N-glycans المسمى بمعدل تدفق 0.4 مل في الدقيقة ، مع تدرج خطي من 75٪ إلى 62٪ أسيتونيتريل لمدة 25 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإجراء تشغيل تحليلي بواسطة سلم معايرة ديكستران / عمود جليكوببتيد على UPLC عند 60 درجة مئوية.

كشف تألق N-glycan عند أطوال موجية للإثارة والانبعاث تبلغ 330 نانومتر و 420 نانومتر على التوالي.