موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 3:05 دقيقة • July 8th, 2025
تسهل بروتينات الغشاء المتكاملة البكتيرية ، المثبتة على أغشية ثنائية الطبقة الدهنية ، نقل الجزيئات عبر الأغشية ونقل الإشارات. بالنسبة للدراسات الهيكلية ، يتم التعبير عن البروتينات المؤتلفة الغشائية المتكاملة المحددة ببروتين الفلورسنت الأخضر المنصهر ، GFP.
لتقييم استقرار بروتين الغشاء المؤتلف بعد إذابة المنظفات ، احصل على جزء غشاء بكتيري يحتوي على بروتينات غشاء متكاملة تحمل علامة GFP. أضف منظفا غير أيوني. بالإضافة إلى التركيز الحرج ، يشكل المنظف مذيلات.
تتفاعل Micelles مع الأغشية الدهنية وبروتينات الغشاء ، مما يؤدي إلى إذابة الأغشية وتشكيل مجمعات البروتين والمنظفات. بالإضافة إلى ذلك ، قد تظل مناطق الغشاء الكارهة للماء لبروتينات الغشاء مكشوفة ، مما يتسبب في تراكم البروتين. علاوة على ذلك ، قد ينتج عن GFPs الحرة بسبب تدهور بروتينات الغشاء.
الطرد المركزي الخليط. اجمع المادة الطافية المحتوية على الأجزاء القابلة للذوبان بالمنظفات.
قم بتجميع عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم المتصل بكاشف الفلورة. تتكون مصفوفة العمود من حبات الاغاروز بأحجام مسام تحدد نطاق تجزئة واسع.
قم بموازنة العمود بمخزن مؤقت يحتوي على منظف لتقليل التفاعلات غير المحددة والحفاظ على إذابة البروتين.
قم بتحميل جزء الغشاء المذاب في العمود. تتهرب مجاميع البروتين من أكبر المسام وتتحرك عبر الفراغات بين الجسيمات بين الخرز ، وتتخلص أولا. تدخل مجمعات المنظفات البروتينية الأصغر عددا قليلا من المسام في الخرزات ، وتعبر مسارا أطول ، وتتخلص لاحقا. تدخل GFPs المجانية جميع مسام الخرزة وتتخلص أخيرا. يحلل كاشف التألق الكسور المملوءة ، ويكشف عن التألق المنبعث من GFP.
تشير قمم التألق المتماثلة لمجمعات المنظفات البروتينية مع الحد الأدنى من الركام و GFP الحر إلى ملاءمة المنظف لإذابة البروتين الغشائي
بالنسبة لكروماتوغرافيا استبعاد الحجم المكتشفة بالفلورة أو تحليل FSEC ، بعد ذلك ، قم بموازنة عمود استبعاد الحجم بنطاق تجزئة واسع مع مخزن مؤقت للتدفق الجاري بمعدل 0.3 ملليلتر في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بحقن 100 ميكرولتر من عينة الغشاء القابلة للذوبان على العمود بنفس معدل التدفق ، وراقب ملف تعريف الوهم باستخدام بصريات الفلورة.