فحص نشاط الإنزيم القائم على كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة: تقنية لتحديد نشاط بيروفوسفوكيناز في المختبر باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

يحفز بيروفوسفوكيناز نقل ثنائي الفوسفات أو البيروفوسفات من سلائف النيوكليوتيدات ، مثل أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، ATP ، إلى الركيزة مثل ثنائي فوسفات الجوانوزين ، الناتج المحلي الإجمالي. هذا يشكل غوانوزين رابع الفوسفات - جزيء إشارة مهم.

لتحديد نشاط البيروفوسفوكيناز ، قم بإعداد خليط تفاعل يشتمل على الناتج المحلي الإجمالي و ATPs المصنفة إشعاعيا في مخزن مؤقت مناسب مكمل بكلوريد المغنيسيوم. أضف الكمية المطلوبة من البيروفوسفوكيناز إلى خليط التفاعل واحتضنها.

بمرور الوقت ، في وجود أيونات المغنيسيوم ، يبدأ البيروفوسفوكيناز في نقل جزء البيروفوسفات المليء بالإشعاع من ATP إلى الناتج المحلي الإجمالي ، مما ينتج عنه رباعي فوسفات جوانوزين مشع.

الآن ، خذ طبقة رقيقة من الكروماتوغرافيا أو TLC ، صفيحة مطلية مسبقا بالبولي إيثيلينيمين السليلوز - مرحلة ثابتة قائمة على البوليمر الكاتيوني. يتم تحليل الحصص الموضعية لخليط التفاعل بالقرب من قاعدة صفيحة TLC في نقاط زمنية مختلفة لإيقاف التفاعل وتقييم التقدم.

اغمر اللوحة في غرفة زجاجية تحتوي على فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة - مذيب طور متحرك. عندما تتحرك جبهة المذيب لأعلى ، تبدأ التحليلات سالبة الشحنة في الهجرة بناء على تقاربها مع المرحلة الثابتة موجبة الشحنة.

تحدد الاختلافات في الشحنات السالبة ووزن التحليلات الفسفرية المختلفة هجرتها النسبية على لوحة TLC ، مما يسمح لها بتثبيت الحركة كنطاقات متميزة.

عندما تصل مقدمة المذيب إلى المسافة المطلوبة ، قم بإزالة اللوحة وجففها في الهواء. قم بقياس شدة الإشارة المشعة ، المقابلة لاستنفاد ATP المسمى إشعاعيا وتراكم رباعي الفوسفات غوانوزين لتحليل نشاط البيروفوسفوكيناز.

قبل إجراء التفاعل ، قم بإعداد ألواح كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة من السليلوز PEI عن طريق غسلها بالماء منزوع الأيونات. ضع الألواح في حجرة زجاجية بماء مقطر مزدوج على عمق 0.5 سم تقريبا. بعد السماح للماء بالهجرة إلى أعلى الطبق ، أخرج الأطباق من الحجرة الزجاجية ، واتركها على رف على الطاولة حتى تجف طوال الليل.

ضع علامة على الألواح الجافة 2 سم من حافة واحدة بقلم رصاص ناعم ، للإشارة إلى مكان تطبيق العينات على TLC. للحصول على عينات 2 ميكرولتر ، ضع عينات لا تقل عن 1 سم. عند التخطيط للتجارب ، اترك دائما بقعة واحدة على كل لوحة غير مستخدمة ، لتكون بمثابة ممر فارغ لقياس العينة.

لإجراء مقايسة نشاط الإنزيم ، قم بإعداد تفاعلات فردية باستخدام ^γ-32P-ATP ، كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف RSH بعد خلط المكونات الأخرى ، حيث أن إضافة RSH إلى المزيج المحتوي على النيوكليوتيدات يبدأ مقايسة النشاط الأنزيمي.

للتحكم في التحلل المائي ATP من نشاط النوكلياز الملوث ، قم بتجميع تفاعل 10 ميكرولتر لا يحتوي على بروتين ، واحتضانه بالتوازي. ضع عينات 2 ميكرولتر عند t = 0 ، وفي نهاية التجربة للتأكد من أن ATP لم يتم تحللها في حالة عدم وجود بروتين.

فور إضافة RSH ، قم بإزالة 2 ميكرولتر ، ووضعها على لوحة السليلوز PEI المسمى كعينة t = 0 دقيقة.

احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية ، مع إزالة 2 ميكرولتر من الحصص في النقاط الزمنية المطلوبة. بعد جمع جميع الحصص ، قم بإجراء كروماتوغرافيا رقيقة الطبقة عن طريق ملء غرفة الكروماتوغرافيا ب 1.5 مولار من فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة على عمق 0.5 سم. اغمر الحافة السفلية للوحة في المذيب ، واترك المذيب ينتقل إلى أعلى اللوحة على مدار 90 دقيقة تقريبا.

قم بإزالة اللوحة من خزان الكروماتوغرافيا ، وضعها على رف تجفيف على الطاولة لتجف في الهواء طوال الليل. بعد أن تجف اللوحة ، لف اللوحة بغشاء بلاستيكي لتجنب نقل المواد المشعة إلى كاسيت التصوير ، وقم بتحليلها بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي.

قم بتعريض صفيحة السليلوز PEI التي تحتوي على تفاعلات منفصلة إلى كاسيت فوسفور لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. بعد التعريض الضوئي ، قم بتصوير الكاسيت على فوسفوريجر.

باستخدام برنامج التصوير مع واجهة مستخدم رسومية ، ارسم مناطق الاهتمام ، أو عائد الاستثمار ، عن طريق تحديد "رسم مستطيل" أولا. بعد ذلك ، استخدم الماوس لرسم عائد استثمار مستطيل حول ممر واحد كامل ، وبقع ATP و guanosine tetraphosphate الموجودة داخل هذا الممر.

استخدم أوامر "التحديد والنسخ واللصق" لرسم عائد استثمار متطابق داخل الممرات الأخرى، للتأكد من أن عائد الاستثمار يقيس الإشارات داخل مناطق متطابقة في كل حارة. قم بتضمين عائد الاستثمار من حارة غير مستخدمة لاستخدامها كفراغات.

باستخدام "تحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار | Add" أوامر برنامج التصوير ، وحدد جميع عائد الاستثمار المرسوم على لوحة السليلوز PEI. الآن ، استخدم "تحليل | تعيين القياسات | قياس "لقياس شدة الإشارة داخل كل عائد استثمار ، وتصدير القياسات كجدول بيانات. في جدول البيانات، اطرح قيم عائد الاستثمار الفارغة من الإشارات التجريبية.