فحص نشاط الإنزيم القائم على كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة: تقنية لتحديد نشاط بيروفوسفوكيناز في المختبر باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

يحفز بيروفوسفوكيناز نقل ثنائي الفوسفات أو البيروفوسفات من سلائف النيوكليوتيدات ، مثل أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، ATP ، إلى الركيزة مثل ثنائي فوسفات الجوانوزين ، الناتج المحلي الإجمالي. هذا يشكل غوانوزين رابع الفوسفات - جزيء إشارة مهم.

لتحديد نشاط البيروفوسفوكيناز ، قم بإعداد خليط تفاعل يشتمل على الناتج المحلي الإجمالي و ATPs المصنفة إشعاعيا في مخزن مؤقت مناسب مكمل بكلوريد المغنيسيوم. أضف الكمية المطلوبة من البيروفوسفوكيناز إلى خليط التفاعل واحتضنها.

بمرور الوقت ، في وجود أيونات المغنيسيوم ، يبدأ البيروفوسفوكيناز في نقل جزء البيروفوسفات المليء بالإشعاع من ATP إلى الناتج المحلي الإجمالي ، مما ينتج عنه رباعي فوسفات جوانوزين مشع.

الآن ، خذ طبقة رقيقة من الكروماتوغرافيا أو TLC ، صفيحة مطلية مسبقا بالبولي إيثيلينيمين السليلوز - مرحلة ثابتة قائمة على البوليمر الكاتيوني. يتم تحليل الحصص الموضعية لخليط التفاعل بالقرب من قاعدة صفيحة TLC في نقاط زمنية مختلفة لإيقاف التفاعل وتقييم التقدم.

اغمر اللوحة في غرفة زجاجية تحتوي على فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة - مذيب طور متحرك. عندما تتحرك جبهة المذيب لأعلى ، تبدأ التحليلات سالبة الشحنة في الهجرة بناء على تقاربها مع المرحلة الثابتة موجبة الشحنة.

تحدد الاختلافات في الشحنات السالبة ووزن التحليلات الفسفرية المختلفة هجرتها النسبية على لوحة TLC ، مما يسم