الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد: تقنية تحليلية للكشف عن كبريتات الهيباران ذات أطوال السلسلة المتفاوتة المعزولة من أنسجة رئة الفأر

الجليكوزامينوجليكان المكبريت مثل كبريتات الهيباران ، HSs ، هي عديد السكاريد سالب الشحنة ، خطي ، كبريتات ذات أطوال سلسلة متغيرة ، متصلة ببروتينات سطح الخلية.

لتقدير HSs ذات الطول المختلف المعزولة من أنسجة رئة الفئران ، ابدأ بتجميع كاسيت الجل. املأه جزئيا بمحلول أكريلاميد ثنائي الساكريلاميد عالي التركيز ، بما في ذلك عوامل التحفيز - بيرسلفات الأمونيوم ورترا ميثيل إيثيلين ديامين. تراكب بالماء لمنع ملامسة الهواء ، مما قد يمنع البلمرة. حضن.

تعمل عوامل التحفيز على بلمرة الأكريلاميد والبيساكريلاميد ، وتشكيل جل لحل المسام الصغيرة. تخلص من الماء. أضف تركيزا منخفضا من محلول الأكريلاميد ثنائي الساكريلاميد مع عوامل التحفيز. أدخل مشط هلام لإنشاء آبار. يتبلمر المحلول ، ويشكل جل تكديس كبير المسام.

قم بتحميل غرف خزان الرحلان الكهربائي بعازل تشغيل للحصول على الموصلية الكهربائية المثلى أثناء الرحلان الكهربائي.

قم بإذابة خليط HS في مخزن التحميل الذي يحتوي على صبغة التتبع والسكروز. بعد ذلك ، انقل هذا الخليط وسلالم HS القياسية إلى آبار الكاسيت. يحصر السكروز الخليط على الآبار. تساعد الصبغة في مراقبة تطور الرحلان الكهربائي.

بدء الرحلان الكهربائي عند الجهد المنخفض. تعبر HSs سالبة الشحنة هلام التكديس ، وتتحرك نحو الأنود موجب الشحنة ، وتركز في واجهة هلام حل التكديس بسبب اختلاف حجم المسام.

زيادة الجهد. تهاجر HSs ذات السلسلة الصغيرة بسرعة عبر هلام الحل ، وتعبر أبعد من ذلك ، بينما يتم احتجاز HSs طويلة السلسلة داخل مصفوفة الهلام وتتحرك ببطء.

بعد الرحلان الكهربائي ، وصمة عار الجل. تظهر HSs كنطاقات متميزة ، مع وضع HSs ذات السلسلة الصغيرة أقل من HSs طويلة السلسلة.

ابدأ بوضع كاسيت فارغ في خزان PAGE. صب الجل القابل للحل عن طريق خلط 10 ملليلتر من محلول الجل المذاب مع 60 ميكرولتر من بيرسلفات الأمونيوم 10٪ المحضرة حديثا في أنبوب سعة 15 مل. ثم أضف 10 ميكرولتر من TEMED. اقلب الأنبوب برفق من 2 إلى 3 مرات.

أضف بسرعة 10 مل من محلول هلام بولي أكريلاميد المنشط إلى الكاسيت باستخدام ماصة. تراكب ب 2 مل من الماء المصفى منزوع الأيونات ، واترك الجل القابل للذوبان يتبلمر لمدة 30 دقيقة.

بعد أن يتبلمر جل المحلول بالكامل ، تخلص من الماء المتراكب. صب جل التكديس عن طريق خلط 3 ملليلتر من محلول هلام التكديس مع 90 ميكرولتر من بيرسلفات الأمونيوم 10٪ المحضرة حديثا في أنبوب سعة 15 ملليلترا. ثم أضف 3 ميكرولتر من TEMED ، واقلب الأنبوب برفق 2 إلى 3 مرات.

استخدم ماصة لإضافة محلول هلام التكديس بسرعة فوق جل المذلبان المتصلب، حتى يمتلئ الدرج حتى أسنانه. أدخل المشط المرفق بالكامل مع كاسيت هلام بولي أكريلاميد الفارغ ، واترك جل التكديس بالبلمرة لمدة 30 دقيقة. بمجرد بلمرة الجل ، قم بإزالة شريط الشريط من أسفل الكاسيت ، ثم ضع الكاسيت مرة أخرى في مجموعة خزان PAGE. املأ الغرف العلوية والسفلية بالحلول العازلة المعنية.

قم بإذابة عينات الجليكوزامينوجليكان المجففة في الحد الأدنى من الحجم اللازم من المياه منزوعة الأيونات والمفلترة ، واخلطها مع مخزن مؤقت لتحميل العينات بنسبة 1 إلى 1. قم بتحميل العينات وسلالم قليلة السكاريد HS في الجل.

أعد تشغيل الجل لمدة 5 دقائق عند 100 فولت. ثم قم بتشغيله عند 200 فولت لمدة 20 إلى 100 دقيقة ، اعتمادا على نسبة مادة الأكريلاميد لمحلول الجل المحلل.