الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم لتحليل البروتين: تقنية لفصل البروتينات وتصورها بناء على الوزن الجزيئي

ابدأ بمعالجة عينة البروتين بمخزن مؤقت لتغيير الطبيعة يتكون من منظف - كبريتات دوديسيل الصوديوم ، SDS ، وعامل اختزال - بيتا ميركابتو إيثانول. سخنيها لفترة وجيزة. خلال هذه الخطوة ، يعطل بيتا ميركابتو إيثانول روابط ثاني كبريتيد ، مما يجعل التشكل غير مكشوف للبروتين.

ترتبط البروتينات المكشوفة مع الأحماض الأمينية الكارهة للماء المكشوفة ب SDS سالب الشحنة وتكتسب شحنة سالبة موحدة. أضف صبغة تتبع مناسبة إلى العينة للتصور في الوقت الفعلي.

الآن ، قم بتحميل العينة وعلامة الحجم الجزيئي القياسية في آبار منفصلة موجودة في هلام التكديس - الطبقة العليا من هلام بولي أكريلاميد التي تحتوي على تركيز أقل من بوليمرات الأكريلاميد المتشابكة.

قم بتوصيل جهاز الجل المملوء بالعازلة بمصدر الطاقة.

في وجود مجال كهربائي ، تهاجر البروتينات سالبة الشحنة بحرية نحو الأنود وتتراكم معا لدخول هلام الحل - الطبقة السفلية التي تحتوي على هلام عالي التركيز.

في هلام الحل ، تبدأ البروتينات في الهجرة وفقا لحجمها الجزيئي ، مع هجرة البروتينات الأصغر بسرعة ، مما يؤدي إلى عصابات بروتينية محلولة على النحو الأمثل. بعد ذلك ، أوقف الجري وقم بإزالة الجل.

قم

بتلطيخ الجل بصبغة أنيونية ، Coomassie blue ، التي ترتبط إلكتروستاتيكيا بالأحماض الأمينية الأساسية في البروتينات ، مما يضفي عليها اللون الأزرق. بعد ذلك ، قم بإزالة الجل في محلول حمض الأسيتيك لتحسين التصور.

قم بإزالة الجل وتحديد البروتينات المنفصلة بناء على أوزانها الجزيئية المقدرة.

قم بإعداد اثنين من المواد الهلامية المنفصلة كما هو موضح في المخطوطة النصية. صب الجل بين الألواح الزجاجية باستخدام ماصة سعة 1 مليلتر ، مع التأكد من خلو الجزء العلوي من 2 سم من الخليط. أضف 70٪ من الإيثانول فوق الجل المنفصل ، مما يخلق واجهة متساوية بين الطبقتين.

بمجرد بلمرة المواد الهلامية المنفصلة ، قم بإعداد المواد الهلامية للتكديس باستخدام التعليمات الموجودة في المخطوطة النصية. ثم قم بإزالة الإيثانول من المواد الهلامية المنفصلة ، وأضف محلول هلام التكديس. أدخل مشطا بعناية مع العدد المطلوب من الجيوب ، دون إدخال فقاعات هواء ، واترك الجل يتبلمر لمدة 20 إلى 30 دقيقة.

قم بتحميل 4 ميكرولتر من كل عينة ، بالإضافة إلى سلم البروتين ، في آبار منفصلة. بعد ذلك ، قم بتشغيل الجل في مخزن مؤقت تشغيل Tris-Glycine عند 144 فولت لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم محلول فيربانكس A الدافئ مسبقا لتلطيخ المواد الهلامية على الروك لمدة 30 دقيقة ، ومحلول فيربانكس الدافئ مسبقا D لإزالة لون المواد الهلامية على الروك حتى يتم تحقيق الخلفية المطلوبة.