تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد اليوريا لتحليل الحمض النووي الريبي: تقنية لفصل قليل النوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الفسفرية المسمى بالفلورسنت عن نظيراتها غير الفسفرية

للبدء ، خذ عينة تحتوي على قليل نوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الفسفرية وغير الفسفرية الممزوجة بصبغة التحميل التي تحتوي على اليوريا. تسخين العينة.

اليوريا - مادة مسحة قوية - بالاشتراك مع الحرارة تشوه بنية الحمض النووي الريبي الثانوية ، مما يؤدي إلى تشكلها الخطي وغير المنظم. الآن ، قم بصب الجل عن طريق خلط محلول الأكريلاميد وثنائي الساكريلاميد مع اليوريا.

أضف رباعي الميثيلين ديامين ، وهو محفز ، وبيرسلفات الأمونيوم ، وهو عامل مؤكسد ، لتسهيل بلمرة الهلام اللاحقة.

صب المحلول في جهاز كاسيت مجمع مسبقا. أدخل مشطا ، وقم بإنشاء آبار لتحميل العينات. دع الجل يتبلمر. ضع الكاسيت في جهاز الجل. أضف عازلة قيد التشغيل إلى الخزانات العلوية والسفلية ، مع الحفاظ على تدفق التيار عبر الجل بأكمله. قم بإزالة المشط.

قم بتحميل العينة الممزوجة بصبغة التصور في البئر وقم بتوصيل الجل بمصدر طاقة بالجهد المطلوب. تسمح اليوريا الموجودة في الجل لجزيئات الحمض النووي الريبي بالهجرة كأنواع خطية.

يعمل الجل كغربال ، مما يسمح لجزيئات الحمض النووي الريبي سالبة الشحنة بالتحرك عبر المسام باتجاه القطب الموجب. أثناء الجري ، يتحرك الحمض النووي الريبي الفسفوري بطبيعته أكثر سلبية بشكل أسرع من الحمض النووي الريبي غير الفسفري.

قم بتصوير الجل للكشف عن الحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت. لاحظ تحول الحركة بين الحمض النووي الريبي الفسفوري الأسرع المهاجر ، والذي يظهر كنطاق أقل مقارنة بالحمض النووي الريبي غير الفسفري.

لتحضير محلول هلام أكريلاميد متغير الطبيعة بنسبة 15٪ ، امزج 22.5 مل من محلول أكريلاميد / ثنائي أكريلاميد بنسبة 40٪ 29: 1 ، و 6 ملليلتر من 10X TBE ، و 28.8 جراما من اليوريا ، والماء الخالي من RNase بحجم إجمالي يبلغ 59 ملليلترا. ثم حرك المحلول برفق.

سخني المحلول في الميكروويف لمدة 20 ثانية ، وحركيه ، ثم أعده على الفور إلى الميكروويف لمدة 20 ثانية أخرى. حرك المحلول برفق حتى تذوب اليوريا تماما. ضع الدورق الزجاجي في حمام مائي ضحل يحتوي على ماء بارد لمدة 5 دقائق ، مع التأكد من أن مستوى الماء البارد المحيط بالدورق الزجاجي أعلى من مستوى المحلول داخل الدورق الزجاجي. عندما يكون المحلول باردا ، قم بتصفيته وإزالة الغاز منه باستخدام وحدة ترشيح يمكن التخلص منها 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات وفقاعات الهواء المجهرية.

اغسل صفيحة زجاجية قصيرة وطويلة بالماء والصابون. بعد ذلك ، رش كل طبق بنسبة 95٪ من الإيثانول ، وامسح الزجاج لإزالة أي رطوبة. ارفع اللوحة الطويلة عن أعلى المقعد بوضعها فوق الصندوق. ثم ضع فواصل 0.4 ملم على طول الحواف الطويلة للوحة. ضع اللوحة القصيرة أعلى اللوحة الطويلة ، مع التأكد من محاذاة حواف اللوحة القصيرة واللوحة الطويلة والفواصل الفاصلة. بعد ذلك ، قم بتثبيت كل جانب بثلاثة مشابك معدنية متباعدة بشكل متساو.

أضف 24 ميكرولترا من TEMED إلى محلول الأكريلاميد واخلطه. ثم أضف 600 ميكرولتر من 10٪ APS ، واسكب المحلول على الفور بين الألواح الزجاجية.

قد يكون صب محلول الأكريلاميد بين شطيرة الألواح الزجاجية أمرا صعبا حقا. لتجنب فقاعات الهواء ، اضغط على شطيرة اللوحة الزجاجية أثناء صب المحلول.

بعناية ، أضف مشطا نظيفا بسعة 32 بئرا إلى الجزء العلوي من شطيرة اللوحة الزجاجية ، واترك مادة الأكريلاميد تتبلمر لمدة 30 دقيقة.

لتشغيل الجل ، اضبط كتلة الحرارة على 75 درجة مئوية ، وقم بإزالة المشابك المعدنية ، واغسل وجفف شطيرة اللوحة الزجاجية جيدا. ضع شطيرة اللوحة في جهاز الجل بحيث تكون اللوحة القصيرة متجهة للأمام ، وقم بإعداد عازل تشغيل 0.5X TBE عن طريق الجمع بين 100 مل من 10X TBE مع 1.9 لتر من الماء الخالي من RNase.

أضف 600 مل من المخزن المؤقت للتشغيل إلى الغرف العلوية والسفلية للجهاز. قم بإزالة المشط برفق من الجل واشطف الآبار جيدا باستخدام حقنة. قم بتشغيل الجل مسبقا على 50 واط لمدة 30 دقيقة. ثم اشطف الآبار مرة أخرى.

قم بتدوير التفاعلات المروية ، واحتضانها عند 75 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. كرر دوران النبض ، وقم بتحميل 10 ميكرولتر على الفور من كل عينة على الجل. ثم قم بتشغيل الجل لمدة 3 ساعات عند 50 واط. عند انتهاء التشغيل ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة واستنزاف الغرفة العلوية للجهاز.

اغسل وجفف الجانب الخارجي من شطيرة اللوحة الزجاجية. ثم قم بتغطيته بورق الألمنيوم ونقله إلى ماسح ضوئي ليزر للتصوير. قم بتركيب شطيرة اللوحة الزجاجية على مسرح الماسح الضوئي بالليزر ، واضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث للفلوروفور المطلوب ، وقم بتصوير الجل.