الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ثنائي الأبعاد شبه المتغير: تقنية لفصل ألياف الأميلويد متعددة الأشكال بناء على عدم تجانس الحجم

ألياف الأميلويد عبارة عن مجاميع من البروتينات غير المطوية ، والتي تظهر عدم تجانس الحجم. يمكن تحليل هذه الألياف ، كونها مقاومة للمنظفات الأنيونية مثل SDS ، باستخدام الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ثنائي الأبعاد شبه المتغير.

للبدء ، خذ جل الاغاروز المجمع مسبقا بحجم المسام الكبير الذي يحتوي على SDS. تسمح المسامية العالية بفصل الألياف السليمة أثناء الجري. تراكب الجل بمخزن مؤقت قيد التشغيل يحتوي على SDS.

قم بتحميل محللة خلية تحتوي على ألياف الأميلويد في الجل. يؤدي وجود SDS وغياب خطوة تسخين العينة إلى خلق ظروف شبه تغيير الطبيعة حيث يرتبط المنظف بالأميلويد عالي المقاومة مما يضفي شحنة سالبة موحدة على الألياف السليمة.

قم بتشغيل الجل في البعد الأول بالجهد المناسب. يتسبب المجال الكهربائي في هجرة الأميلويد سالب الشحنة نحو الأنود موجب الشحنة.

أثناء الجري ، تهاجر الألياف الأصغر بسرعة مقارنة بالألياف الأكبر حجما - وتشكل نمطا شبكيا يشبه اللطاخة يشير إلى عدم تجانس الحجم.

عند الانتهاء ، قم بتدوير الجل بشكل عمودي وقم بتشغيله في البعد الثاني. في هذا البعد ، تتحرك الألياف بشكل مماثل إلى التشغيل الأول الذي يفصل بناء على أحجامها. هذا يخلق مسحة قطرية حيث تهاجر الألياف الأصغر بشكل أسرع من الألياف الأكبر.

يؤكد

تكوين الشريط القطري الحاد وجود مجموعة ليفية أميلويد سليمة ولكنها غير متجانسة.

لتحضير الجل ، أضف 2 جرام من مسحوق الاغاروز إلى 200 مل من محلول TAE في دورق زجاجي. ثم سخني الدورق في الميكروويف لإذابة الاغاروز.

بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من 20٪ SDS إلى التركيز النهائي 0.1٪. حرك الدورق برفق.

بعد ذلك ، اسكب سائل agarose على لوح هلام مقاس 15 سم × 14 سم. لإزالة أي فقاعات هواء، استخدم ماصة سعة 1 ملليلتر. ثم ضع مشطا بسعة 20 جيدا فوق الجل.

بعد ذلك ، أضف ما يقرب من 60 ميكروغراما من محللة الخلية الكاملة في أقصى الممر الأيمن للجل. قم بتشغيل الجل عند 60 فولت لمدة أربع ساعات تقريبا ، باستخدام المخزن المؤقت TAE الذي يحتوي على 0.1٪ SDS ، كمخزن مؤقت للتشغيل.

لتشغيل الجل في البعد الثاني ، قم بتدوير الجل بعناية بمقدار 90 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة. ثم قم بتشغيل السجن عند 60 فولت لمدة أربع ساعات تقريبا.