JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 3:10 د • July 8th, 2025
لتحليل مجمعات الميتوكوندريا الخمسة لسلسلة الجهاز التنفسي بوحدات فرعية سليمة ، احصل على مجمعات الميتوكوندريا القابلة للذوبان في منظف خفيف غير أيوني. تخلط مع المخزن المؤقت الذي يحتوي على Coomassie Blue-G ، وهي صبغة أنيونية.
يستبدل Coomassie المنظف ويرتبط بشكل غير محدد بالمجمعات ، مما يضفي شحنة سالبة ويلطخها باللون الأزرق. بالإضافة إلى ذلك ، يمنع Coomassie المجمعات من التراكم ويساعد في الحفاظ على هيكلها الأصلي ووظيفتها.
في خزان الرحلان الكهربائي ، قم بتجميع كاسيت جل يشتمل على جل لحل التدرج مع تناقص حجم المسام على طول الطول ، مغطى بهلام تكديس كبير بحجم المسام. املأ غرف الأنود والكاثود بأنود مبرد ومخزن كاثود يحتوي على كوماسي.
قم بتحميل الآبار بخليط مركب البروتين المرتبط ب Coomassie. بدء الرحلان الكهربائي.
تهاجر مجمعات البروتين سالبة الشحنة من هلام التكديس إلى هلام حل التدرج ، باتجاه الأنود موجب الشحنة. بينما تعبر المجمعات الأصغر بسرعة عبر المسام ، يتم إبطاء المجمعات الأكبر حجما بسبب أحجام المسام المقيدة أثناء تحركها لأسفل الجل المحلل.
يتم استبدال Coomassie المنفصلة عن المجمعات أثناء الجري ب Coomassie في مخزن الكاثود ، مما يمنع المجمعات من التحول من مواقعها الخاصة في الجل. بعد الرحلان الكهربائي ، تصور الجل. تظهر مجمعات الميتوكوندريا على شكل أشرطة زرقاء يتم حلها وفقا للحجم.
يحتلالمركب الثاني بأقل وزن جزيئي أدنى موضع على الهلام ، يليه المركب الرابع والثالث والخامس ، ويحتل المركب الأول بأعلى وزن جزيئي المرتبة الأولى.
لإجراء الرحلان الكهربائي للهلام الأزرق الأصلي ، أولا ، أضف المخزن المؤقت للكاثود الأزرق إلى كاسيت الجل. استخدم ماصة لغسل وملء الآبار بمحلول الكاثود الأزرق. ثم قم بتحميل 5 إلى 30 ميكروغراما من عينات البروتين في الآبار. املأ كاسيت الجل برفق إلى الأعلى بمخزن الكاثود الأزرق ، والخزان بمخزن الأنود.
أولا ، قم بتشغيل الجل بجهد ثابت يبلغ 40 فولت لمدة 15 دقيقة. ثم قم بزيادة الجهد إلى 80 فولت. قم بتشغيل الجل حتى تصل الصبغة إلى 2/3 من طول الجل. استبدل المخزن المؤقت للكاثود الأزرق بمخزن الكاثود المؤقت ، واستمر في الرحلان الكهربائي حتى تنفد واجهة الصبغة من الجل.