الرحلان الكهربائي الشعري: تقنية لتحليل أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل المسمى بالفلورسنت

لتحديد حجم شظايا الحمض النووي باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري ، ابدأ بأخذ لوحة فحص متعددة الآبار. يحتوي كل بئر على أمبليكون PCR ذات علامات فلورية ومختلفة الحجم - قليل النوكليوتيدات DNA مزدوجة الشريطة تم الحصول عليها بعد دورة PCR.

أضف عددا قليلا من شظايا الحمض النووي ذات الأحجام المختلفة ومزدوجة الشريطة إلى البئر ، والتي تعمل كمعيار للحجم. يحمل كل جزيء من جزيئات الحمض النووي علامة الفلورسنت لسهولة التعرف عليها.

استكمل البئر بالفورماميد ، وهو مادة مسحة قوية ، وقم بتسخينها على درجة حرارة عالية. تعمل هذه الخطوة على تغيير طبيعة الحمض النووي ، وتشكيل شظايا أحادية الشريطة يمكن أن تهاجر بسهولة عبر مسام الجل.

ضع اللوحة في وحدة محلل الشظايا التي تحتوي على هلام بوليمر محقون مسبقا داخل نظام الشعيرات الدموية.

قم بتطبيق جهد عال لإدخال الحمض النووي كهربائيا من البئر إلى الشعيرات الدموية ذات القطر الرقيق عند الكاثود - الطرف السالب. تهاجر جزيئات الحمض النووي سالبة الشحنة نحو الأنود موجب الشحنة. تواجه خيوط الحمض النووي الأقصر قوة احتكاك أقل وتتحرك بشكل أسرع عبر الجل من خيوط الحمض النووي الأطول.

أثناء الهجرة الكهربائية ، يعبر الحمض النووي مسار شعاع الليزر ، مما يؤدي إلى تألق الصبغة. يتم التقاط إشارات الانبعاث من الصبغة بواسطة كاشف ويتم ترجمتها لاحقا إلى مخطط كهربية - رسم بياني يمثل كل حمض نووي فلوري كذروة فردية مختلفة اللون.

قارن ذروة جزء الحمض النووي غير المعروف مع القمم المرجعية لتحليل حجمها.

بعد تأكيد مكبرات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم شرائط أو ألواح PCR جديدة ، لتخفيف منتجات PCR من 1 إلى 10 في الماء النقي. دوامة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. أثناء العمل في خزانة الدخان ، قم بإعداد مزيج رئيسي في أنبوب طرد مركزي يتكون من فورماميد ومحلول قياسي بالحجم المرجعي.

وفقا لعدد منتجات PCR المراد تحليلها ، استخدم مجلدات الكاشف ، كما هو مفصل في المخطوطة. اسمح بفائض حجم بنسبة 10٪.

دوامة لفترة وجيزة وتوزيع 9.5 ميكرولتر في آبار فردية على لوحة PCR ، مناسبة لنظام الرحلان الكهربائي الشعري المتاح. ثم أضف 0.5 ميكرولتر من منتج PCR المخفف. ختم وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة.

بعد ذلك ، قم بتحميل اللوحة التي تحتوي على العينات في جهاز تدوير حراري PCR ، وقم بتغيير طبيعة العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، قبل أن تبرد إلى 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. جهاز طرد مركزي عند 1,000 × جم لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة الختم بعناية ، وقم بتحميل اللوحة على نظام الرحلان الكهربائي الشعري المعاير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للشعيرات الدموية لتحليل الشظايا باستخدام الكواشف حسب الملاءمة للجهاز المختار ، وضبط ظروف التشغيل وفقا للوصف الوارد في المخطوطة.