JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 2:44 د • July 8th, 2025
يتم تثبيت البروتينات متعددة الكبريتيد عن طريق الروابط بين الجزيئية والتساهمية وثاني كبريتيد بين بقايا السيستين وهو أمر بالغ الأهمية في الحفاظ على سلامتها الهيكلية والوظيفية.
لتحليل هذه المجمعات عن طريق PAGE غير المختزل ، خذ التركيز المطلوب للبروتينات المستقرة بثاني كبريتيد. أضف عازلة عينة غير مختزلة وقم بتسخين العينة.
يحتوي هذا المخزن المؤقت على SDS ، الذي يضفي شحنة سالبة إجمالية على البروتينات ، وصبغة تتبع لتصور حركتها في الجل. يفتقر المخزن المؤقت إلى أي عامل اختزال ، مما يسمح لروابط ثاني كبريتيد بالبقاء دون إصابة ، مما يسهل بقاء المركب متعدد الكبريتيد سليما.
قم بتحميل المجمعات الفردية في آبار هلام بولي أكريلاميد النسبة المطلوبة ، مجمعة مسبقا في جهاز هلام. أضف سلم بروتين بحجم معروف في بئر آخر. اغمر الآبار في مخزن مؤقت قائم على SDS وقم بتوصيل الجهاز بمصدر طاقة.
يجبر التيار الكهربائي مجمعات البروتين سالبة الشحنة على التحرك عبر مسام الجل باتجاه الأنود - الطرف الموجب. نظرا لأن مجمعات البروتين سالبة الشحنة بشكل موحد ، يحدث الفصل بناء على الحجم ، حيث تشكل الموضربات نطاقا بارزا للوزن الجزيئي الأعلى في موضع معين.
قارن حجم شريط البروتين المنفصل بالسلم. يؤكد عدم وجود نطاقات ذات وزن جزيئي منخفض في الجل الفصل الناجح للمجمعات متعددة العضلات السليمة.
قم بإعداد 1 لتر من 1X Tris-glycine Running Buffer عن طريق خلط 25 مللي مولار Tris و 192 مللي مولار جلايسين و 0.1٪ وزن لكل حجم SDS. بعد ذلك ، قم بإعداد جهاز تشغيل SDS-PAGE.
افتح حزمة TGX SDS-PAGE مسبقة البث بنسبة 16٪ وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، وقم بإزالة الكاسيت. قم بإزالة المشط الذي يبطن الآبار والشريط من أسفل الكاسيت ، وضع الجل في جهاز التشغيل. املأ الغرفة بمخزن مؤقت 1X ، حتى تغمر الآبار في السائل.
باستخدام ماصة بلاستيكية ، اشطف الآبار باستخدام المخزن المؤقت الجاري. قم بتحميل العينات على الجل مع 10 ميكرولتر من العلامة القياسية الملطخة مسبقا. أخيرا ، قم بتشغيل الجل عند 200 فولت حتى تصبح مقدمة الصبغة على بعد حوالي 1 سم من أسفل الجل.