الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد ثنائي الأبعاد: تقنية فصل لتحليل البروتينات في خليط البروتين المركب بناء على الشحنة والوزن الجزيئي

بالنسبة للرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد لخليط البروتين المشتق من أنسجة الورم المتجانسة ، عالج بمخزن مؤقت يحتوي على chaotropes ، ومنظفات zwitterionic ، وعامل اختزال. تعمل Chaotropes والمنظفات على تشويه وحل البروتينات. تعمل عوامل الاختزال على تقليل روابط ثاني كبريتيد البروتينات ، مما يؤدي إلى توليد مجموعات ثيول حرة وكشف البروتينات للحصول على دقة مثالية للبروتين.

انقل خليط البروتين المعالج إلى تدرج الأس الهيدروجيني الثابت ، IPG ، حامل الشريط. ضع شريط IPG الذي يشتمل على تدرج الأس الهيدروجيني الخطي داخل مصفوفة هلام الأكريلاميد. أضف الزيت المعدني لمنع تبخر محلول البروتين. انقل الحامل إلى نظام تركيز متساوي الكهرباء. اسمح لمحلول البروتين بإعادة ترطيب الشريط.

إجراء IEF البعد الأول. يتسبب التيار الكهربائي في هجرة البروتينات المشحونة عبر تدرج الأس الهيدروجيني نحو الأقطاب الكهربائية ذات الشحنة المعاكسة ، مما يؤدي إلى تثبيت النقاط المتساوية الكهرباء الخاصة بها - الأس الهيدروجيني الذي يكون للبروتينات عنده شحنة صافية صفرية

بعد IEF ، عالج شريط IPG بكبريتات دوديسيل الصوديوم ، SDS ، وهو منظف أنيوني يضفي شحنة سالبة على البروتينات. التوازن مع عامل مؤلكل لتعديل مجموعات الثيول البروتينية ، مما يضمن قابلية ذوبان البروتين أثناء الرحلان الكهربائي.

قم بتحميل الشريط على جل مسبقة الصب صغير المسام لحل بولي أكريلاميد وقم بتثبيته باستخدام الاغاروز المنصهر. املأ الغرف بمخزن الرحلان الكهربائي المحتوي على SDS. بدء الرحلان الكهربائي للبعد الثاني ، عموديا على IEF.

تتحرك البروتينات ذات الوزن الجزيئي الأكبر سالبة الشحنة عبر الجل ببطء نحو الأنود موجب الشحنة مقارنة بالبروتينات الأصغر ، مما يسهل الفصل القائم على الحجم.

وصمة عار الجل. يمكن تصور البروتينات على أنها بقع منفصلة على الجل.

لبدء هذا الإجراء ، أضف 250 ميكرولترا من محلول عينة البروتين المعد مسبقا إلى كل فتحة لحامل شريط IPG مقاس 13 سم. ضع شريط IPG بطول 18 سم ، بحيث يكون جانب الجل لأسفل ، على كل محلول عينة بروتين ، مع الحرص على تجنب الفقاعات. ثم أضف 3 إلى 4 ملليلتر من الزيت المعدني لتغطية كل شريط IPG.

بعد ذلك ، قم بتجميع كل حامل شريط IPG في نظام تركيز متساوي الكهرباء ، مع الطرف المدبب على اللوحة الخلفية ، والطرف المربع على اللوحة الأمامية. بعد إعادة ترطيب شرائط IPG لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، قم بتعيين معلمات IEF على نظام التركيز المتساوي الكهربي بإجمالي وقت تشغيل يبلغ 7.5 ساعة و 36,875 فولت ساعة.

بعد IEF ، أخرج كل شريط IPG من نظام التركيز المتساوي الكهربي ، وقم بإزالة الزيت المعدني الزائد بمنشفة ورقية غير قابلة للذوبان. ثم لف كل شريط في ورقة من غلاف بلاستيكي ، واحفظه على حرارة -80 درجة مئوية.

لصب جل PAGE بنسبة 12٪ ، أضف الماء المقطر المزدوج ، و 1.5 مولي من محلول Tris-hydrochloric ، و 40٪ محلول مخزون من الأكريلاميد / البيساكريلاميد ، و 10٪ بيرسلفات الأمونيوم ، و TEMED إلى دورق امزج محلول الجل برفق ، مع الحرص على تجنب الفقاعات.

صب محلول الجل برفق في غرفة متعددة الصب ، حتى ارتفاع الجل المتوقع البالغ 19 سم. على الفور ، أضف حوالي 3 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج إلى غرفة الصب المتعددة لتغطية كل هلام قابل للحل ، واترك كل هلام يتبلمر لمدة ساعة تقريبا.

هذه الخطوة مهمة جدا لتحضير جل SDS-PAGE عالي الجودة. يجب إضافة ماء متساو الحجم على الفور في الجزء العلوي من كل جل.

قم بإعداد لترين من المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي ، ثم أضف المخزن المؤقت إلى خزان عازلة لوحدة فصل الرحلان الكهربائي.

بعد إزالة شرائط IPG المركزة من الفريزر ، ضعها في وعاء بلاستيكي يحتوي على 1 مليلتر من مخزن التوازن المختزل وأثر من اللون الأزرق البروموفينول ، وقم بتوازنها لمدة 10 دقائق مع هزاز لطيف. بعد إزالة المخزن المؤقت للتوازن المختزل ، أضف 4 ملليلتر من المخزن المؤقت لتوازن الألكلة ، وأثر من البروموفينول الأزرق إلى شرائط IPG ، وقم بتوازنها لمدة 10 دقائق مع هزاز لطيف.

أثناء توازن الهلام ، قم بتفكيك غرفة الصب المتعددة ، وقم بإزالة كاسيت هلام الحل المعد. اشطف كاسيت الجل ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج ، ثم قم بإزالة الماء الزائد من كاسيت الجل بمنشفة ورقية غير قابلة للذوبان ، وضعها في حامل جل.

بعد ذلك ، اشطف شرائط IPG المتوازنة باستخدام المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي ، وقم بإزالة السائل الزائد على كل سطح شريط IPG بمنشفة ورقية غير قابلة للذوبان. ضع شريط IPG على جل SDS-PAGE القابل للحل ، مما يسمح للجانب البلاستيكي لشريط IPG بالاتصال باللوحة الزجاجية الأطول ، مع الطرف المدبب إلى اليسار.

الآن ، أضف بسرعة 3 إلى 4 ملليلتر من المخزن المؤقت الساخن 1٪ من الاغاروز و SDS الكهربائي ، لإغلاق شريط IPG في الجزء العلوي من كل جل SDS-PAGE ، ووضع الجانب العلوي من شريط IPG لأسفل في الجزء العلوي من اللوحة الزجاجية الأقصر ، مع الحرص على تجنب الفقاعات.

هذه الخطوات مهمة جدا لإغلاق شريط IPG بهلام SDS-PAGE. يجب إضافة محاليل الاغاروز الساخنة على الفور ، ويجب وضع شريط IPG على الفور في الجزء العلوي من جل SDS.

بعد البلمرة ، أدخل كاسيت الجل المجمع عموديا بين الحشيات البلاستيكية ونظام الرحلان الكهربائي الرأسي. ضع الجزء العلوي من الجل مع شريط IPG بجوار الكاثود. بعد ذلك ، اضبط مستوى المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي لغمر كاسيت الجل عن طريق إضافة الحجم المناسب من المخزن المؤقت إلى نظام الرحلان الكهربائي.

قم بتوصيل وضبط مصدر الطاقة في وضع الجهد الثابت ، وقم بتشغيله عند 200 فولت لمدة 370 دقيقة تقريبا أثناء مراقبة الصبغة. بعد اكتمال التشغيل ، أخرج كاسيت الجل من نظام الرحلان الكهربائي وقم بإزالة الجل برفق من علبة الجل ، مع الحرص على تجنب تمزق الجل.