الرحلان الكهربائي للهلام بالزيموغرافيا: تقنية كهربائية للكشف عن البروتينات المعدنية المصفوفة من خلال تقييم النشاط الأنزيمي

يتم

إفراز مصفوفة البروتيناز المعدني ، أو MMP ، وهو بروتياز متعدد المجالات يشتمل على مجالات البروببتيد والتحفيزية ، كإنزيم غير نشط أو زيموجين بواسطة خلايا معينة. التفاعل بين أيون الزنك في المجال التحفيزي وبقايا السيستين في مجال البروببتيد يحافظ على MMP غير نشط.

للكشف عن MMPs في الطاف لزراعة الخلايا عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الزيموغرافيا ، املأ خزان الرحلان الكهربائي الذي يحتوي على كاسيت هلام بكبريتات دوديسيل الصوديوم أو المخزن المؤقت المحتوي على SDS.

قم بتحميل المادة الطافية المزروعة الممزوجة بمخزن التحميل ، متبوعا بمعايير البروتين ، في آبار من هلام بولي أكريلاميد ، مبلمرة مشتركة مع ركيزة بروتينية خاصة ب MMP.

SDS ، وهو منظف سالب الشحنة ، في ظل ظروف غير مختزلة ، يعطل تفاعلات السيستين والزنك في MMPs ويفسد طبيعة البروتينات بينما يضفي شحنة سالبة.

أداء الرحلان الكهربائي. يتسبب المجال الكهربائي في هجرة البروتينات سالبة الشحنة نحو الأنود موجب الشحنة ، مما يتسبب في فصل البروتينات على أساس الحجم.

بعد الرحلان الكهربائي ، عالج الجل بمحلول إعادة تشكيل غير أيوني يحتوي على منظفات. تحل المنظفات غير الأيونية محل SDS ، وتعيد تكوين البروتينات وتستعيد نشاط MMP جزئيا. تتم معالجة MMPs أيضا إلى حالة نشطة بالكامل.

احتضان في مخزن مؤقت نامي يحتوي على كاتيونات معدنية ثنائية التكافؤ ضرورية لنشاط MMP. MMPs النشطة ، جنبا إلى جنب مع الكاتيونات ، تهضم ركيزة MMP في الجل. اغسل الجل لإزالة المنتجات المهضومة. وصمة عار الجل.

تظهر مناطق نشاط MMP ، الخالية من ركيزة MMP ، كشرائط شفافة على خلفية زرقاء داكنة من الركيزة غير المهضومة. باستخدام برنامج مناسب ، يمكن ربط كثافة شريط الهلام بنشاط MMP.

قبل بدء هذا البروتوكول ، قم بإعداد جميع البروتينات المعدنية المصفوفة ، أو MMPs ، بشكل كاف للحفاظ على وظيفة الإنزيمات. يمكن استخدام العينات على الفور أو تخزينها عند -80 درجة مئوية. هنا يستخدم MMP-2 ، المعروف أيضا باسم الجيلاتيناز A أو النوع الرابع من الكولاجيناز ، لإثبات تصور نشاط MMP باستخدام علم الزيموغرافيا.

بمجرد تحضير إنزيمات MMP ، احصل على كيس جل جيلاتين 10٪ يحتوي على مادة هلامية داخل كاسيت. اشطف الكاسيت بالماء منزوع الأيونات. قم بإزالة الشريط الواقي من أسفل الكاسيت والمشط من أعلى الجل. اشطف الآبار ثلاث مرات باستخدام عازلة تشغيل Tris-Glycine SDS.

ضع الجل في جهاز الرحلان الكهربائي ذو الخلايا الصغيرة ، مع التأكد من أن الجانب الأصغر من الكاسيت متجها للداخل. أثبت الجل في مكانه باستخدام Gel Tension Wedge. املأ الغرفة العلوية للجهاز بمخزن مؤقت يعمل Tris-Glycine SDS فوق مستوى الآبار ، وتحقق من وجود أي تسريبات. املأ الغرفة السفلية لإعداد الرحلان الكهربائي للهلام بعازل تشغيل أيضا.

ثم قم بتحميل 10 ميكرولتر من العلامة الجزيئية للبروتين.

امزج كمية متساوية من العينة في مخزن مؤقت لتحميل الهلام لا يحتوي على عوامل مختزلة. على عكس SDS-PAGE العادي ، لا تغلي العينات ، وبدلا من ذلك قم بتحميلها مباشرة في آبار الجل ، باستخدام أطراف تحميل الهلام. يمكن أن تستوعب هذه الآبار ما يصل إلى 20 ميكرولترا من الحجم.

ضع الغطاء على الخلية الصغيرة ، وقم بتوصيل أسلاك القطب الكهربائي بمصدر الطاقة. قم بتشغيل مصدر الطاقة واضبط الجل على التشغيل عند 125 فولت ، ثابتا لمدة 90 دقيقة. تحقق من تكوين فقاعات صغيرة على سلك الغرفة السفلية ، مما يشير إلى دوران التيار.

عند تشغيل الجل الأول ، راقب تقدم الترحيل كل 15 دقيقة ، باستخدام البروموفينول الأزرق المضمن في مخزن التحميل كمؤشر. لكل هلام ، قم بإعداد 100 مل من 1X المخزن المؤقت لإعادة الرسم البياني ، و 200 مل من المخزن المؤقت لتطوير الزيموغرام ، وكلاهما في الماء منزوع الأيونات.

عندما تصل صبغة التتبع الزرقاء البروموفينول إلى قاع الجل ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة.

افتح الخلية الصغيرة وقم بإزالة الجل. افصل جانبي الكاسيت باستخدام سكين جل. قطع زاوية لتحديد اتجاه الجل. قم بإزالة الجل بعناية من الكاسيت ، وضعه في وعاء به 100 مل من المخزن المؤقت لإعادة التنصيب.

احتضن الجل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف.

قم بإزالة المخزن المؤقت لإعادة التكوين ، وأضف 100 مل من المخزن المؤقت النامي إلى الجل. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف.

بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت النامي ، وأضف 100 مل إضافي من المخزن المؤقت الجديد إلى الجل. احتضن الجل طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة طوال الليل ، قم بإزالة المخزن المؤقت النامي ، واغسل الجل عن طريق احتضانه بالماء منزوع الأيونات ، تحت التحريك اللطيف ، لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذا الغسيل مرتين.

ضع الجل على واقي من البلاستيك ، وقم بإزالة الفقاعات. بعد ذلك ، امسح الجل ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي لحفظ الوضع الدقيق للأشرطة القياسية للبروتين ، حيث ستصبح بالكاد مرئية بعد تلطيخ الجل.

قم

بتلطيخ الجل بإضافة 20 مل من SimplyBlue SafeStain إلى الجل. احتضان الجل لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، تحت التحريك اللطيف.

قم بإزالة SimplyBlue SafeStain ، وقم بإزالة الجل في 100 مل من الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة تحت تحريك لطيف.

بعد 1 ساعة ، استبدلها بالماء المنعش منزوع الأيونات ، واستمر في احتضان الجل لمدة ساعة واحدة على الأقل.