مقايسة الخبعة المناعية متعددة التحليلات: تقنية المقايسة المناعية القائمة على التدفق للكشف المتزامن عن أنواع فرعية متعددة من الأجسام المضادة في عينة المصل البشري

يستخدم اختبار الخرزة المناعية متعددة التحليلات كريات مجهرية متعددة مغلفة بالمستضد للتعرف على الأجسام المضادة المستهدفة المقابلة لها في وقت واحد.

لبدء هذا الفحص ، خذ مزيجا من الميكروبيدات في أنبوب يحتوي على المخزن المؤقت المناسب. كل حبة مطلية بمستضد معين على سطحها ، مما يسمح بسهولة التمييز بين الخرزات وبعضها البعض.

ماصة خليط الخرزة المناعية المطلية في آبار لوحة فحص ميكروتيتر. استكمل الآبار بعينة المصل التي تحتوي على أنماط تماثلية مختلفة من الأجسام المضادة المستهدفة. هذه المتغيرات لها اختلافات طفيفة في هياكلها ، مما يسمح لكل بئر بالحصول على أجسام مضادة أولية متعددة.

احتضان ، للسماح للأنماط التماثلية للأجسام المضادة للعينة بالالتصاق بمستضدات معينة تم التقاطها على الخرزات المناعية المعنية. يغسل باستخدام مخزن مؤقت للفحص لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة. أضف الأجسام المضادة الثانوية ذات العلامات الصبغة الفلورية ، المقابلة لكل متغير من الأجسام المضادة الأولية ، في البئر.

يرتبط كل جسم مضاد ثانوي مصنف بموقع Fc للجسم المضاد الأساسي المعني. يتم تصنيف العديد من مجمعات الأجسام المضادة الأولية للمستضد التي تم التقاطها بواسطة الخرز. اغسل اللوحة لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة.

اقرأ اللوحة باستخدام محلل الفلورسنت القادر على الكشف المتزامن عن الفلوروفورات المختلفة بأطوال موجية خاصة بها. اعتمادا على اكتشاف الإشارة ، يمكن تقييم الأنماط الإسوية المختلفة للأجسام المضادة في الدم وارتباطها بمستضدات مختلفة.

للحصول على أداء الفحص ، قم بتعليق الكريات المجهرية المقترنة بواسطة الدوامة لمدة 30 ثانية ، وصوتنة لمدة 60 إلى 90 ثانية. بعد ذلك ، قم بإزالة الكمية المطلوبة من كل غروية حبة من الأنبوب المعني ، واجمع الغرويات الخرزية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مقاس 1.5 ملم.

بعد ذلك ، أدخل الأنبوب في فاصل مغناطيسي ، واترك الفصل لمدة 60 ثانية. مع بقاء الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة المادة الطافية ، دون إزعاج حبيبات الخرزة.

بعد إزالة الخرزات من الفاصل ، قم بتعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص. دوامة لمدة 30 ثانية قبل وضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي لمدة 60 ثانية ، لفصل الخرز. كرر الغسيل مرتين.

بعد ذلك ، اضبط تركيز خليط الكرة المجهرية العاملة ثلاثي الطبقات عن طريق إضافة حجم مناسب من المخزن المؤقت للفحص لتوليد تركيز نهائي يبلغ 100 كرة دقيقة لكل 1 ميكرولتر ، لكل هدف.

Aliquot 25 ميكرولترا من خليط الكرة المجهرية في كل بئر من لوح 96 بئرا. قم بتخفيف عينات البلازما أو المصل 500 مرة في المخزن المؤقت للفحص ، وقم بإعداد العينات القياسية وفقا للمعايرة بالتحليل الحجمي المطلوبة.

أضف 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص كعينة فارغة ، وأضف كل من العينات المخففة أو المعيار ، في كل بئر معين من لوحة عينة مكونة من 96 بئرا. عند الانتهاء ، قم بتغطية اللوحة بختم أو رقائق معدنية من الألومنيوم لاحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر لوحة مضبوطة على 700 دورة في الدقيقة.

قم بإعداد محلول من الأجسام المضادة للكشف عن الإنسان ، أو محاليل الأجسام المضادة الثانوية ، عند 4 ميكروغرام / مل مع مخزن الفحص المؤقت ، كما هو موضح في المخطوطة. ضع اللوحة على فاصل مغناطيسي لغسلها بسرعة ، ثم اقلب اللوحة بقوة فوق حاوية بيولوجية لإزالة السائل من الآبار. مع استمرار اللوحة مقلوبة ، اضغط بقوة على اللوحة على رزمة سميكة من الورق.

بعد ذلك ، اغسل كل بئر ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص ، وقم بإزالة السائل عن طريق الانعكاس القوي فوق حاوية بيولوجية. كرر الغسيل مرتين. بعد الغسيل الأخير ، تخلص من جميع حزم الورق المستخدمة في حاوية بيولوجية.

بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من محلول عمل الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر من لوح مكون من 96 بئرا ، وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم لاحتضانها على شاكر اللوحة بسرعة 700 دورة في الدقيقة.

بعد 30 دقيقة من الحضانة ، اغسل آبار اللوحة مرتين باستخدام عازلة الفحص ، كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص في كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا. غطي الطبق بورق الألمنيوم ، واحتضنه لمدة خمس دقائق على شاكر الطبق في درجة حرارة الغرفة.

قم بتحليل عينة سعة 60 ميكرولتر عبر محلل الأداة وفقا لدليل النظام.