مقايسة تماثل الخلايا المجهرية على شكل حلقة: تقنية في المختبر لتحديد التماثل متعدد الخلايا بناء على محاذاة الخلية على الأنماط الدقيقة على شكل حلقة

لتحديد تماثل خلايا الثدييات في المختبر - التحيز بين اليسار واليمين للخلايا لمحاذاة الاتجاه إلى اليسار أو اليمين في ظل ظروف محصورة - ابدأ بشرائح مطلية بالذهب مصنوعة حسب الطلب في صفيحة متعددة الآبار تحتوي على الوسائط. تتكون الشرائح من أنماط دقيقة من الجزر على شكل حلقة من الفيبرونكتين المعزز للالتصاق الخلية ، مملوءة بطبقة أحادية التجميع ذاتية المقاومة للالتصاق الخلية.

بعد ذلك ، قم بزرع كمية مناسبة من تعليق خلايا الثدييات على الشرائح واحتضانها. تمتص الخلايا على الأنماط الدقيقة الحلقية المحتوية على الفيبرونكتين. تمنع الطبقة الأحادية المحيطة ذاتية التجميع ارتباط الخلية غير المحددة خارج حدود الحلقة.

استبدل الوسائط ، وقم بإزالة أي خلايا غير متصلة ، بوسائط جديدة. أضف دواء متداخل للأكتين إلى مجموعة واحدة من الشرائح واحتضنها.

تتكاثر الخلايا الملتصقة وتنتشر وتتخذ شكل جزر الفبرونيكتين الأساسية ، بينما تعيد تنظيم ألياف الأكتين استجابة للإشارات المكانية ، التي تحصر الطبقة الأحادية للخلية ، مما يعزز المحاذاة المتحيزة.

الآن ، عالج الشرائح باستخدام بارافورمالدهيد لتثبيت الخلايا. تحت الفحص المجهري لتباين الطور ، تظهر الخلايا الموجودة على الأنماط الدقيقة الحلقية كمناطق مظلمة ذات ملامح ساطعة محاذاة وفقا لتحيزها التفضيلي.

باستخدام البرنامج ، احسب زاوية محاذاة كل خلية على أنها انحراف عن الاتجاه المحيطي للحلقة. متوسط لتحديد تماثل خلايا الثدييات. قد تظهر الخلايا المعالجة بالأدوية المسببة للتداخل مع الأكتين تماثل عكسي.

قبل بذر الخلايا ، قم بتسخين الوسائط والتربسين في حمام مائي ، خفف عند 37 درجة مئوية.

للحصول على ارتباط أفضل للخلية ، انقع الشريحة المزخرفة في صفيحة مكونة من 12 بئرا تحتوي على وسائط مزرعة ، وقم بتسخينها عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. بمجرد أن يتم تربسين الخلايا ، قم بتحييد الخلايا بوسائط تحتوي على FBS. حبيبات الخلايا عند 100 × جم لمدة 3 دقائق, ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في وسائط جديدة. عد الخلايا ، وتخفيف تعليق الخلية لتحقيق تركيز 200,000 خلية لكل ملليلتر.

أضف 0.5 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر يحتوي على شريحة ذهبية واحدة. رج الطبق برفق عدة مرات لتلقيح الخلايا بشكل موحد ، قبل احتضانه لمدة 15 دقيقة لربط الخلية. بعد 15 دقيقة ، تحقق من مرفق الخلية تحت المجهر ، وإذا لزم الأمر ، احتضن لبعض الوقت.

بمجرد توصيل الخلايا ، قم بشفط الوسائط التي تحتوي على خلايا غير متصلة من كل بئر ، وأضف 1 مليلتر من وسائط الثقافة الطازجة. قم بزراعة الخلايا في الحاضنة لمدة 24 ساعة وتحقق من التقاء لتحديد ما إذا كان التماثل قد تشكل.

عند تحقيق التقاء المطلوب ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إزالة وسائط الثقافة. بعد الشطف باستخدام PBS مرة واحدة ، أضف محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ إلى الشريحة ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، قبل شطفه مرة أخرى باستخدام PBS ثلاث مرات.

للحصول على الصور ، استخدم مجهر تباين الطور مع وظيفة الكاميرا ، والتقط كل حلقة على الشريحة بدقة عالية.

لتوصيف التماثل ، قم بتنزيل ملفات التعليمات البرمجية MATLAB. أضف مجلد التعليمات البرمجية والمجلدات الفرعية إلى مسار MATLAB وافتح ملف "ROI_selection.m". في السطر 4 ، قم بتغيير الدليل إلى مجلد البيانات المطلوب.

قم بتغيير حجم الصورة في السطر 14 ، حيث يمثل الشكلان الأولان حجم الدائرة الداخلية للحلقة ، بينما يمثل الشكلان الآخران حجم الدائرة الخارجية.

لتحديد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار في صور تباين الطور ، قم بتنفيذ كود MATLAB "ROI_selection.m" m بالنقر فوق الزر تشغيل. اسحب مربع التحديد يدويا ليناسب الحلقة ، ثم انقر نقرا مزدوجا فوق الصورة لتأكيد التحديد.

بعد تحديد عائد الاستثمار من جميع الصور الموجودة في المجلد ، سيتم إنشاء ملف ".mat" لتخزين معلومات عائد الاستثمار لكل صورة. بعد ذلك ، افتح ملف "Analysis_batch.m" وقم بتغيير دليل المجلد كما هو موضح من قبل. انقر فوق الزر "تشغيل" لتنفيذ الكود "Analysis_batch.m" لتحديد تماثل أنماط الحلقات الخلوية المتعددة.

سيتم إنشاء ملف "datatoexcel.txt" يحتوي على إحصائيات دائرية لكل حلقة ، بالإضافة إلى عدد الحلقات في اتجاه عقارب الساعة وغير اللولبية وعكس اتجاه عقارب الساعة.