فحص التقاط الجسيمات الشبيهة بالفيروسات: طريقة لعزل VLPs التي تعرض المستضد من عينة باستخدام حبات مغناطيسية مترافقة بالأجسام المضادة المعادلة

JoVE Encyclopedia of Experiments

التقنيات البيولوجية

0 مشاهدات • 4:27 د • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفرز الخلايا الأجسام المضادة المعادلة ، أو NAbs ، لحمايتها من الفيروسات الغازية.

لدراسة تفاعلات NAbs مع الفيروسات ، استخدم جزيئات شبيهة بالفيروسات هندسية ، أو VLPs. تحتوي هذه الهياكل النانوية على مجموعة من البروتينات المشتقة من الفيروسات بدون مادة وراثية فيروسية ، مما يجعلها غير معدية. تحيط ب VLPs طبقة ثنائية دهنية مدمجة ببروتينات سكرية مغلفة مستضدية ، والتي تقدم حاتمة معادلة ، وهي منطقة متخصصة ترتبط بها NAbs.

أضف VLPs إلى أنبوب يحتوي على أجسام مضادة معادلة مرتبطة بخرز مغناطيسي مترافق بالبروتين. احتضن تحت التحريض لمنع الخرز من الاستقرار. أثناء الحضانة ، تتعرف منطقة الحاتمة في VLPs على الباراتوب التكميلي في منطقة Fab من NAbs ، مما ينتج عنه مجمعات من المستضد والأجسام المضادة. وهذا بدوره يساعد الخرزات المغناطيسية على التقاط VLPs.

ضع الأنبوب في رف فصل مزود بمغناطيس قوي. تحت تأثير المجال المغناطيسي ، تتحرك الخرزات المعقدة ب VLPs نحو المغناطيس دون إزعاج تفاعل المستضد والأجسام المضادة. تلتقط هذه الخطوة VLPs المرتبطة ، بينما تظل تلك التي تفتقر إلى مستضدات معينة في المادة الطافية.

تخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات بمخزن الغسيل لإزالة VLPs غير المرتبطة. قم بإعادة تعليق مجمعات حبة VLP في مخزن مؤقت للشطف ، مما يؤدي إلى فك ارتباط VLPs عن الخرزات وظهورها في المادة الطافية.

استنشق VLPs المعزولة التي تعرض المستضد في أنبوب جديد ، وقم بتخزينها في التبريد لمزيد من التحليل.

ابدأ بإعادة تعليق الخرزات المغناطيسية إما عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل أو الخلط على دوار بسرعة 50 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على الأقل.

في هذه الأثناء ، قم بإعداد محلول الجسم المضاد الذي يحتوي على bNAbs. استخدم 10 ميكروغرام من كل bNAb و 200 ميكرولتر من مخزن المخزن المؤقت لربط الأجسام المضادة والغسيل لكل تفاعل. لكل تفاعل ، انقل 50 ميكرولترا من محلول الخرزة المغناطيسية إلى أنبوب تفاعل سعة 1.5 ملليلتر ، ثم ضع الأنابيب على رف الفصل المغناطيسي.

انتظر حتى تتجمع الخرزات عند جدار الأنبوب للتأكد من جمع جميع الخرزات ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. قم بإزالة المغناطيس الخرزات في 200 ميكرولتر من محلول bNAb المعد مسبقا.

احتضن لمدة 30 دقيقة إلى 3 ساعات ، مع الخلط على دوار بسرعة 50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، ضع أنابيب التفاعل في رف الفصل المغناطيسي ، وانتظر ، وقم بإزالة المادة الطافية.

قم بإزالة الأنابيب من المغناطيس ، واغسل الخرزات عن طريق تعليق 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط الأجسام المضادة والغسيل. كرر الغسيل باستخدام مخزن مؤقت لربط الأجسام المضادة والغسيل ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من مخزن الغسيل عند الانتهاء.

أضف العينات إلى bNAbs المرتبطة بالخرزة. إذا كان حجم العينة المضاف أقل من 1 ملليلتر ، فأضف PBS لضبط حجم العينة إلى 1 مليلتر ، ثم أعد تعليق الخرزات عن طريق سحب العينة برفق. احتضان العينات والخرز لمدة 2.5 ساعة على دوار في درجة حرارة الغرفة ، مع التأكد من بقاء الخرزات في حالة تعليق ، وخلط المحلول جيدا أثناء الحضانة.

ضع الأنابيب على المغناطيس ، وقم بإزالة المادة الطافية. ثم اغسل الخرزات المغناطيسية عن طريق تعليقها في 200 ميكرولتر من محلول الغسيل. قم بتعليق الخرزات في 100 مل من عازلة الغسيل ، وانقل التعليق إلى أنبوب تفاعل نظيف مقاوم للحرارة. ضع الأنبوب على رف الفصل المغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية تماما.

لتحضير عينات SDS-PAGE مشوهة ، قم بتعليق الخرزات في 20 إلى 80 ميكرولترا من عازلة Laemmli ، واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تابع مباشرة مع SDS-PAGE ، ووضع الأنابيب على رف مغناطيسي لفصل الخرزات عن المحلول. بدلا من ذلك ، قم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية.

09:28

تحديد تركيز الفيروسي من خلال البلاك فحوصات: نظم تراكب عن طريق التقليدية والرواية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

15:57

تطبيق على المدى الطويل مثقف انترفيرون γ انزيم مرتبط Immunospot الفحص لتقييم المستجيب والذاكرة T الردود خلية في الماشية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

06:17

التعبير وتنقية جزيئات تشبه الفيروسات للتطعيم

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

07:06

الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

08:31

العزلة وتحليل الجينوم Virions واحدة باستخدام 'جينوم فيروس واحد'

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

08:10

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

03:17

تحليل العلاقة المستضدية بين الفيروسات باستخدام مقايسة التحييد الدقيق المستندة إلى الصور

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

04:05

الالتقاط المناعي وقياس التدفق الخلوي للحويصلات خارج الخلية لتوصيف المستضدات

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

06:28

تدفق Virometry لتحليل الأنتيجين أطياف Virions وخارج الخلية الحويصلات

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

07:08

سريع، متعدد المراسل المزدوج IgG وIgM سارس-CoV-2 تحييد المقايسة لنظام تحليل التدفق متعددة الخرز القائم

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

آخر تحديث: 1 أغسطس 2026