مقايسة نشاط سينسيز السترات: اختبار لوني لقياس نشاط سينسيز سترات الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة الأنسجة المتجانسة

داخل الميتوكوندريا ، سينسيز السترات ، الموضعي في مصفوفة غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، هو الإنزيم المحدد للمعدل الذي يحفز التفاعل بين أنزيم الأسيتيل أ وحمض الأكسالو أسيتيك لتكوين السترات ، وهي الخطوة الأولى في دورة حامض الستريك.

لتحليل نشاط سينسيز السترات ، انقل ذبابة الفاكهة البالغة ذبابة الفاكهة الصدر الوفير في الميتوكوندريا إلى أنبوب مملوء بمخزن استخلاص مبرد يحتوي على حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ، EDTA ، ومنظف غير أيوني.

تجانس أنسجة الصدر على الجليد لمنع تمسخ البروتين بوساطة الحرارة. تعمل قوة القص المطبقة ، جنبا إلى جنب مع المنظفات ، على تحلل الأنسجة وتطلق مكونات داخل الخلايا ، بما في ذلك الميتوكوندريا.

علاوة على ذلك ، يؤدي تمزق غشاء الميتوكوندريا الداخلي إلى إطلاق بروتينات مصفوفة الميتوكوندريا ، بما في ذلك سينسيز السترات. يرتبط EDTA بالكاتيونات ثنائية التكافؤ ويمنع نشاط البروتياز ، وبالتالي يمنع تدهور البروتين.

قم بتخفيف التجانس باستخدام المخزن المؤقت للاستخراج وأضف حجما مناسبا إلى خليط التفاعل الذي يحتوي على آبار من الصفيحة متعددة الآبار. يتكون خليط التفاعل من أنزيم الأسيتيل أ وحمض أوكسالو أسيتيك وحمض ثنائي تيونيتروبنزويك.

يحفز سينسيز السترات في المتجانس التفاعل بين حمض الأكسالو أسيتيك وإنزيم الأسيتيل أ ، مكونا السترات والإنزيم المساعد أ مع مجموعة الثيول. تتفاعل مجموعة الثيول مع حمض ثنائي تيونيتروبنزويك عديم اللون ، وتشكل منتجا أصفر ، حمض الثيونيتروبنزويك.

باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس امتصاص المحلول الأصفر. يمكن أن يكون الامتصاص مرتبطا بنشاط سينسيز السترات في تجانس الأنسجة.

انقل 10 من قفص صدر الذباب البالغ إلى 100 ميكرولتر من مخزن الاستخراج المثلج على الفور ، وقم بتجانسها بمدقة على الجليد. حافظ على برودة العينات عن طريق التجانس لمدة خمس إلى 10 ثوان على الجليد ، واتركها على الجليد لمدة خمس ثوان ، ثم كرر ذلك حتى تتجانس جميع الأنسجة تماما.

قم بنقل 10 ميكرولترات من كل عينة متجانسة في أنبوب جديد لقياس محتوى البروتين ، مع الحفاظ على هذه الأنابيب على الجليد أيضا. أضف 400 ميكرولتر من محلول الاستخراج المثلج البارد إلى كل عينة متبقية لحجم إجمالي يبلغ 500 ميكرولتر ، وقم بالماصة لأعلى ولأسفل برفق للخلط.

لكل تفاعل ، أضف 1 ميكرولتر من محللات الخلية المخففة إلى 150 ميكرولتر من محلول التفاعل المحضر حديثا. امزج جيدا عن طريق سحب العينة برفق ، مع التأكد من تجنب تكون الفقاعات. بعد ذلك ، استخدم قارئ الألواح لقياس الامتصاص عند 412 نانومتر كل 10 إلى 30 ثانية لمدة أربع دقائق عند 25 درجة مئوية.

ارسم البيانات على أنها امتصاص بمرور الوقت ، ثم احسب المنحدر للجزء الخطي من المنحنى. أخيرا ، اقسم معدل التفاعل أو المنحدر على تركيز بروتين العينة لتطبيع نشاط سينسيز السترات.