فحص حماية الإنزيم القائم على الليزوستافين: طريقة في المختبر لتحديد الحمل المكورات العنقودية الذهبية داخل الخلايا عن طريق القتل الانتقائي بوساطة الإنزيم للبكتيريا خارج الخلية

JoVE Encyclopedia of Experiments

التقنيات البيولوجية

0 مشاهدات • 4:04 د • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ابدأ بطبقة أحادية من الخلايا الظهارية في وسط ثقافة مناسب. تعبر هذه الخلايا عن الإنتجرينات - مستقبلات سطحية تمتد عبر الغشاء. تحتوي وسائط الثقافة على فيبرونيكتين يفرز الخلايا الظهارية - وهو بروتين سكري.

أضف تعليقا من المكورات العنقودية الذهبية - بكتيريا مسببة للأمراض موجبة الجرام - إلى لوحة الاستزراع. تحتوي هذه البكتيريا على بروتينات مرتبطة بالفبرونكتين ، أو FnBPs ، مثبتة في جدار الخلية.

احتضان الصفيحة لبدء العدوى البكتيرية ، حيث يرتبط الفيبرونيكتين ب FnBP للبكتيريا والإنتجرينات الموجودة على الخلايا المضيفة الظهارية. يتوسط هذا التفاعل الثلاثي FnBP-fibronectin-integrin الاستيعاب البكتيري في المضيف.

عالج الخلايا بالليزوستافين - إنزيم endopeptidase - واحتضانه. يدخل الليزوستافين بشكل انتقائي إلى جدران خلايا البكتيريا خارج الخلية. يشق جسور البنتاجيسين في الببتيدوغليكان ، وبالتالي يحللها بينما تظل البكتيريا داخل الخلايا محمية من الليزوستافين.

استكمل المزرعة بإنزيم محلل للبروتين لتعطيل الليزوستافين المتبقي ، ومنعه من قتل البكتيريا داخل الخلايا في الخطوات.

أضف عازلة تحلل إلى المزرعة ، مما يؤدي إلى تمزق الخلايا الظهارية المضيفة وإطلاق البكتيريا داخل الخلايا في تحلل الخلية. بعد ذلك ، قم بوضع محللة الخلية التي تحتوي على بكتيريا على صفيحة ثقافة مناسبة واحتضنها.

تنمو البكتيريا وتتكاثر لتشكل مستعمرات بكتيرية ، والتي يمكن تحليلها لتقدير مدى استيعاب البكتيريا في الخلايا المضيفة.

قبل تلقيح الخلايا ، راقب كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا عن طريق الفحص المجهري منخفض التكبير للتأكد من أن الخلايا صحية وتنمو كما هو متوقع. بعد ذلك ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا المستهلكة والتخلص منه من اللوحة المكونة من 24 بئرا ، وأضف 500 ميكرولتر من المعلق البكتيري إلى كل بئر يحتوي على خلايا ملتصقة بنسبة 100٪. احتضان الخلايا لمدة ساعتين عند 36 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لتحديد كمية البكتيريا داخل الخلايا باستخدام مقايسة حماية الإنزيم المحسن ، قم بإعداد مخزن التحلل 4X ، و 2٪ Triton X-100 ، و trypsin-EDTA ، ومخزون الليزوستافين ومحاليل العمل كما هو مذكور في المخطوطة النصية.

بعد ذلك ، قم بإعداد 6.25 مل من وسط العدوى الكامل المكمل بالليزوستافين ، عن طريق إضافة 6 ملليلتر من وسط العدوى الكامل إلى 250 ميكرولتر من محلول عمل الليزوستافين. بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من وسط العدوى الكامل المكمل بالليزوستافين في كل بئر ، وقم بتحريك اللوحة برفق عن طريق تدوير اللوحة يدويا.

للسماح لليزوستافين بقتل البكتيريا خارج الخلية ، احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 36 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بتعطيل الليزوستافين عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من البروتيناز K بمعدل 20 ميكروغرام لكل مليلتر في كل بئر ، واحتضان الخلايا لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من محلول التحلل 4X لتحلل الخلايا عن طريق الصدمة التناضحية ، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 36 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتحلل الخلية لأعلى ولأسفل عدة مرات ، لضمان تحلل الخلايا وتجانسها بالكامل.

بعد ذلك ، استخدم طبقا حلزونيا أوتوماتيكيا لتحديد حمل المكورات العنقودية الذهبية لكل بئر ، واحتضان ألواح الأجار لمدة 18 إلى 24 ساعة عند 36 درجة مئوية. في اليوم التالي ، احسب عدد المستعمرات باستخدام عداد مستعمرات لحساب حمل المكورات العنقودية الذهبية داخل الخلايا لكل بئر.

10:40

دراسة تفاعلات المكورات العنقودية الذهبية مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

05:12

نموذج في المختبر لدراسة أثر "العلاج الضوئي" 5-Aminolevulinic حمض-بوساطة على بيوفيلم العنقوديات الذهبية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

12:27

تحديد كميه السمية الخلوية للسبحيه الذهبية ضد الكريات البيضاء البشرية الاحاديه النواة

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

03:14

اختبار السمية الخلوية بوساطة البروتين البكتيري خارج الخلية على PMNs

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

03:35

فحص السمية الخلوية لسلالات المكورات العنقودية الذهبية على العدلات بعد البلعمة

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

06:41

اختبار الأغشية الحيوية للوحة الوتد لفحص العوامل المضادة للبكتيريا

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

12:41

اختبار قابلية المضادات الحيوية الناجم عن الإجهاد على رقاقة

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

10:50

فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

10:00

استهداف بيوفيلم أسوشيتد المكورات العنقودية الذهبية استخدام ريسازورين استنادا الفحص المخدرات-القابلية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

06:36

تحسين فحص حماية الإنزيم لدراسة استوعب المكورات العنقودية والفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

آخر تحديث: 15 أغسطس 2026