JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 3:03 د • July 8th, 2025
في الأنسجة ، يوجد الحديد ، وهو معدن أساسي ضروري لعمليات التمثيل الغذائي المختلفة ، معزولا عن بروتينات الدم وبروتينات الحديد غير الهيم. تشتمل بروتينات الدم على الحديد الحديدي أو الحديد الهيم المرتبط بحلقات البورفيرين ، في حين أن بروتينات الحديد غير الهيم تفتقر إلى بنية حلقة البورفيرين وتتكون في الغالب من الحديد أو الحديد غير الهيم.
لتقدير محتوى الحديد غير الهيم في أنسجة كبد الفأر، عالج شظية من أنسجة كبد الفأر المجففة والمحصودة بتركيزات منخفضة من حمض الهيدروكلوريك وحمض ثلاثي كلورو أسيتيك. احتضان في درجات حرارة عالية لهضم الأنسجة وتسهيل ترسيب البروتين الناجم عن الحمض.
بسبب التركيزات الحمضية المنخفضة ، يتم إطلاق الحديد غير الهيم من البروتينات المرتبطة به. حديد الهيم ، المرتبط بحلقة البورفيرين ، لا يزال غير متأثر.
بعد التبريد ، انقل الحجم المطلوب من المادة الطافية التي تحتوي على حديد غير الهيم إلى صفيحة متعددة الآبار. أضف مخلب الحديد الكروموجينيك ، سلفونات الباثوفينانثرولين ، BPS ، المكمل بحمض الثيوغليكوليك ، عامل اختزال ، في مخزن مؤقت مناسب واحتضان.
يقللحمض الثيوجليكوليك من كل الحديد غير الهيم إلى الحديد الحديدي ، والذي يمكن أن يرتبط بسهولة ب BPS بنسبة 1: 3 ، مكونا مركبا عالي الاستقرار باللون الوردي. بالإضافة إلى ذلك ، يمنع حمض الثيوغليقوليك التداخل بسبب أي كاتيونات فلزية ثنائية التكافؤ ملوثة مثل النحاس قد تتفاعل مع BPS.
ضع اللوحة متعددة الآبار في قارئ صفيحة دقيقة لقياس امتصاص مجمعات BPS الحديدية الوردية ، والتي تمثل تركيز الحديد غير الهيم في جزء أنسجة كبد الفأر.
انقل كل قطعة مجففة من الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. أضف 1 مليلتر من خليط الحمض إلى الأنبوب وأغلقه. قم بإعداد فارغ حمضي بنفس الطريقة ، باستثناء أن الأنسجة محذوفة هنا.
احتضان الأنابيب عند 65 درجة مئوية لمدة 20 ساعة لهضم الأنسجة.
بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، استخدم ماصة دقيقة مزودة بأطراف بلاستيكية لنقل 500 ميكرولتر من مستخلص الحمض الصافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر.
قم بإعداد تفاعلات الكروموجين مباشرة في الصفائح الدقيقة المسطحة القاع ، 96 بئر ، الشفافة ، غير المعالجة ، البوليسترين. احتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
قم بقياس امتصاص العينة في قارئ الألواح بطول موجي يبلغ 535 نانومتر مقابل مرجع مائي منزوع الأيونات.