$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ناقضات العظم ، الضامة متعددة النوى ، تسهل ارتشاف العظام - تكسير أنسجة العظام وإطلاق معادن العظام.
لتحديد كمية ارتشاف ناقضات العظم في المختبر ، قم بزراعة خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة في عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، M-CSF ، الذي يحتوي على وسائط للتمايز إلى خلايا سلف ناقضات العظم وملحقها. حصاد أسلاف ناقضات العظم وأجهزة الطرد المركزي.
ماصة تعليق الخلية المعلقة في الوسائط ، مكملة ب M-CSF ومنشط المستقبلات للعامل النووي kappa-Β ligand ، RANKL ، في آبار صفائح متعددة الآبار مطلية بفوسفات الكالسيوم ، تحاكي مكون العظام غير العضوي. يتسبب M-CSF و RANKL في تمايز سلف ناقضات العظم والاندماج في ناقضات العظم ، مما يؤدي إلى تنشيط الارتشاف.
تلتصق ناقضات العظم المنشطة بطلاء فوسفات الكالسيوم ، وتعيد تنظيم هيكلها الخلوي لتشكيل منطقة مانعة للتسرب غنية بالأكتين ، وتطور حدودا مكشكشة تفرز البروتونات والهيدرولاز الحمضي. تعمل البيئة الحمضية الناتجة على إذابة طلاء فوسفات الكالسيوم ، وإطلاق أيونات الكالسيوم والفوسفات وتشكيل حفرة ارتشاف.
بعد الحضانة ، اغسل الآبار وإزالة الأيونات الذائبة. إصلاح واختراق ناقضات العظم للتلوين اللاحق. تلطيخ خيوط الأكتين بصبغة مناسبة. قم بتلطيخ النوى بصبغة ملزمة للحمض النووي. تلطخ الكالسيوم في طلاء البئر بصبغة ملزمة للكالسيوم.
تحت المجهر الفلوري ، تظهر ناقضات العظم الوظيفية نوى فلورية متعددة وحلقات أكتين ، وهي ضرورية لوظيفة الامتصاص. تظهر حفر الارتشاف على شكل مناطق سوداء على طلاء فوسفات الكالسيوم الفلوري المغطى بحلقات الأكتين.
باستخدام برنامج مناسب ، حدد مساحة الحفرة ، وتحديد ارتشاف العظم.
أعد تعليق PBMCs في ألفا MEM كامل يحتوي على 20 نانوغرام / مل عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، وبذرة 2.5 × 105 خلايا / سم2 PBMCs في قارورة. احتضان الألواح المطلية بفوسفات الكالسيوم ب 50 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنينية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك ، اغسل القارورة مرتين باستخدام PBS لفصل سلائف ناقضات العظم عن الخلايا الميتة أو غير الملتصقة. ثم أضف 4 ملليلتر من التربسين لكل قارورة 75 سم2. بعد 30 دقيقة ، أوقف عملية الهضم بإضافة 4 ملليلتر من ألفا ميم كامل. ثم افصل الخلايا بعناية باستخدام مكشطة الخلية.
انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا باستخدام غرفة العد. الطرد المركزي الأنبوب عند 350 × جم لمدة سبع دقائق لتكوير الخلايا ، وأعد تعليق الحبيبات في ألفا MEM الكامل الذي يحتوي على M-CSF و RANKL للحصول على 1 × 106 خلايا / مل.
شفط مصل الأبقار الجنيني من الصفيحة المطلية بفوسفات الكالسيوم ، وماصة 200 ميكرولتر من معلق الخلية لكل بئر. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق ، واغسلها مرة أخرى باستخدام PBS.
للتلوين ، أضف مخزن مؤقت للنفاذية إلى الخلايا الثابتة ، واحتضنها لمدة خمس دقائق.
لتلطيخ خيوط الأكتين ، احتضان الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول الفالودين المسمى AlexaFluor 546 في PBS لمدة 30 دقيقة. ثم قم بشفط محلول التلوين ، وصمة عار النوى باستخدام 100 ميكرولتر من Hoechst لمدة 10 دقائق.
صبغ
طلاء فوسفات الكالسيوم ب 100 ميكرولتر من 10 ميكرومولار كالسيين في PBS لمدة 10 دقائق. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام PBS ، التقط الصور.