مقايسة سحب الجزيء الواحد لتحليل فسفرة البروتين: تقنية إنتاجية عالية لتحديد فسفرة البروتين في محللة الخلية

تعتبر فسفرة بعض البروتينات الخلوية مهمة لوظيفتها البيولوجية.

لتحديد مستويات الفسفرة للبروتينات السليمة باستخدام مقايسة منسدلة أحادية الجزيء ، ابدأ بأخذ غطاء زجاجي بنمط مصفوفة شبكية. كل حجرة مطلية بالبولي إيثيلين جلايكول البيوتينيل أو الروابط القائمة على PEG متباعدة مع PEG العادي لمنع العوائق الفراغية أثناء ارتباط البروتين.

عالج الغطاء بكاشف مختزل لتقليل التألق الذاتي في التحليل. قم بتراكب الغطاء باستخدام Neutravidins - البروتينات المرتبطة بالبيوتين - واحتضانها ، مما يسمح لها بربط روابط PEG البيوتينية.

استكمل المصفوفة بأجسام مضادة محددة للبروتين المضادة للهدف. يحتوي كل جسم مضاد على البيوتين المرتبط بمنطقة Fc الخاصة به ، مما يساعد على تثبيت الجسم المضاد في النيوترافيدين ، مما يتسبب في تثبيت الشلل.

الآن ، أضف محللة ثقافة الخلية التي تحتوي على بروتينات مختلفة ، بما في ذلك المتغيرات الفسفرية غير الفسفرية ذات العلامات الفلورية الخضراء للبروتين المستهدف ، واحتضنها. يتم التقاط كلا النوعين من البروتين المستهدف بواسطة الأجسام المضادة ، مما يشكل مجمعات. يغسل لإزالة البروتينات غير المرتبطة.

بعد ذلك ، عالج هذه المجمعات بالمجموعة الثانية من الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية الحمراء ، والتي تربط حصريا بقايا البروتين الفسفرة ، مما يضفي إشارة مضان مختلفة إلى المجمع.

قم بتصوير المصفوفة تحت المجه