مقايسة سحب الجزيء الواحد لتحليل فسفرة البروتين: تقنية إنتاجية عالية لتحديد فسفرة البروتين في محللة الخلية

تعتبر فسفرة بعض البروتينات الخلوية مهمة لوظيفتها البيولوجية.

لتحديد مستويات الفسفرة للبروتينات السليمة باستخدام مقايسة منسدلة أحادية الجزيء ، ابدأ بأخذ غطاء زجاجي بنمط مصفوفة شبكية. كل حجرة مطلية بالبولي إيثيلين جلايكول البيوتينيل أو الروابط القائمة على PEG متباعدة مع PEG العادي لمنع العوائق الفراغية أثناء ارتباط البروتين.

عالج الغطاء بكاشف مختزل لتقليل التألق الذاتي في التحليل. قم بتراكب الغطاء باستخدام Neutravidins - البروتينات المرتبطة بالبيوتين - واحتضانها ، مما يسمح لها بربط روابط PEG البيوتينية.

استكمل المصفوفة بأجسام مضادة محددة للبروتين المضادة للهدف. يحتوي كل جسم مضاد على البيوتين المرتبط بمنطقة Fc الخاصة به ، مما يساعد على تثبيت الجسم المضاد في النيوترافيدين ، مما يتسبب في تثبيت الشلل.

الآن ، أضف محللة ثقافة الخلية التي تحتوي على بروتينات مختلفة ، بما في ذلك المتغيرات الفسفرية غير الفسفرية ذات العلامات الفلورية الخضراء للبروتين المستهدف ، واحتضنها. يتم التقاط كلا النوعين من البروتين المستهدف بواسطة الأجسام المضادة ، مما يشكل مجمعات. يغسل لإزالة البروتينات غير المرتبطة.

بعد ذلك ، عالج هذه المجمعات بالمجموعة الثانية من الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية الحمراء ، والتي تربط حصريا بقايا البروتين الفسفرة ، مما يضفي إشارة مضان مختلفة إلى المجمع.

قم بتصوير المصفوفة تحت المجهر الفلوري ولاحظ إشارتين مضان متميزتين. يشير التحديد المشترك لكلتا إشارتي التألق إلى وجود بروتينات فسفرة في العينة.

قم بإزالة المصفوفات الوظيفية من البيوتين - PEG من الفريزر وقم بتوازنها مع درجة حرارة الغرفة. ضع الغطاء بحيث يكون المصفوفة متجها لأعلى فوق طبق زراعة أنسجة مقاس 100 ملم مبطن بغشاء مانع للتسرب. احتضان كل مربع من المصفوفة ب 10 ملليغرام لكل مليلتر من بوروهيدريد الصوديوم و PBS لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS.

بعد ذلك ، احتضن 0.2 ملليغرام لكل مليلتر من NeutrAvidin في T50 لمدة 5 دقائق ، متبوعا بغسلها ثلاث مرات باستخدام T50-BSA. كرر الحضانة بمقدار 2 ميكروغرام لكل مليلتر من الجسم المضاد الخاص ب POI البيوتينيل في T50-BSA لمدة 10 دقائق ، متبوعا بالغسيل.

أولا ، قم بإذابة وخلط المحللة عن طريق سحب العينات. خفف 1 ميكرولتر من المحللة إلى 100 ميكرولتر من T50-BSA / PPI المثلج. احتضان المحللة على المصفوفة لمدة 10 دقائق ، متبوعا بالغسيل. قم بإعداد الجسم المضاد المضاد للفوسفوتيروزين المترافق AF647 في T50-BSA / PPI المثلج ، واحتضانه على المصفوفة لمدة 1 ساعة.

قم بإيداع قطرة من الزيت على الهدف. ضع الشبكة النانوية على المسرح للتصوير. باستخدام الضوء الأبيض المرسل ، ركز على نمط الشبكة. احصل على سلسلة من 20 صورة للشبكة. تأكد من عدم تشبع وحدات البكسل، واحفظ سلسلة الصور على أنها "حسابية".

قم بإلغاء تركيز الشبكة النانوية لإنشاء نمط متجدد الهواء. احصل على سلسلة من 20 صورة لمعايرة الكسب ، واحفظ الصورة ك "Gain". بعد ذلك ، احصل على سلسلة من 20 صورة لإزاحة الكاميرا عن طريق حجب كل الضوء عن الكاميرا ، واحفظ الصورة ك "خلفية".

للحصول على صور SiMPull ، أولا ، قم بتنظيف هدف الزيت ، وإيداع زيت إضافي على الهدف. قم بتأمين مجموعة الغطاء على مرحلة المجهر. احصل على صور لكل عينة ، أولا في القناة الحمراء البعيدة ، متبوعة بالفلوروفورات ذات الطول الموجي المنخفض. تحقق من مستوى المخزن المؤقت كل 30 إلى 45 دقيقة ، وقم بتجديده حسب الحاجة.