موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 4:02 دقيقة • July 8th, 2025
السيبتين هي بروتينات الهيكل الخلوي الرئيسية التي ترتبط بأسطح غشاء البلازما المنحنية.
لمراقبة تجميع septin في المختبر على الكريات المجهرية ، أولا ، خذ تعليقا من حبات السيليكا المجهرية ذات الحجم الموحد ، والتي تعمل كدعم قوي لتكوين الطبقة الثنائية. دوامة هذا التعليق لكسر أي مجموعات الخرز.
استكملها بحويصلات صغيرة أحادية الصفيحة ، وسيارات الدفع الرباعي - حويصلات كروية محاطة بطبقة ثنائية دهنية واحدة. احتضان مع التحريض المستمر ، مما يمنع الكريات المجهرية من الاستقرار.
أثناء الحضانة ، تسهل مجموعات الرأس القطبية الخارجية امتصاص سيارات الدفع الرباعي على سطح الكرة المجهرية المحبة للماء. يتسبب هذا التفاعل في تمزق سيارات الدفع الرباعي ، متبوعا باندماج دهون سيارات الدفع الرباعي على سطح الكرة المجهرية المنحني كطبقة مستمرة ، مما ينتج عنه تكوين طبقة ثنائية دهنية كروية مدعومة ، SLB.
يغسل لإزالة الدهون الزائدة غير المرتبطة وإعادة تعليقه في المخزن المؤقت للتفاعل. انقل معلق SLB الكروي إلى منطقة صغيرة من سطح مطلي بالبولي إيثيلين جلايكول ، لمنع الامتصاص غير المحدد. أضف معلق الحاجز المسمى بالفلورسنت إلى الغرفة واحتضانه.
تشكل Septins قلة قليلة غير متجانسة تتعرف على الانحناء الإيجابي ل SLBs الكروية ، وتبلمر لتشكيل خيوط. في النهاية ، تتفاعل خيوط septin مع بعضها البعض ، مما يؤدي إلى تكوين هياكل ذات ترتيب أعلى.
راقب SLBs المطلية بالحاجز تحت مجهر مضان عالي الدقة. يشير وجود التألق إلى ترسب الحاجز الحساس للانحناء.
أولا ، قم بتدوير الزجاجة التي تحتوي على كريات السيليكا المجهرية لمدة 15 ثانية. ثم ، قم بالصوتنة في الحمام لمدة دقيقة واحدة ، ودوامة مرة أخرى لمدة 15 ثانية لكسر أي مجموعات. امزج الخرزات مع SLBB و 10 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي سعة 5 ملليمولار في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الالتصاق.
احتضان خليط الخرز والدهون لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، على شاكر لمنع الترسيب. في غضون ذلك ، قم بإذابة غطاء PEGylated ، وقم بلصق أنبوب PCR مقطوع سعة 0.2 ملليلتر به. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للحبات لمدة 30 ثانية في RCF المخصص.
بعد الدوران الأول ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من المادة الطافية ثم أضف 200 ميكرولتر من PRB واخلطها عن طريق سحب العينة القوي. بالنسبة للجولات التالية ، قم بإزالة 200 ميكرولتر من PRB ، وأضف 200 ميكرولتر أخرى بعد الدوران الثاني والثالث ، وأضف 220 ميكرولتر من PRB بعد الدوران الرابع.
إذا أجريت فحصا منافسا بأحجام حبة متعددة ، فقم بإعداد التفاعل عن طريق خلط كميات متساوية من كل حجم حبة ، وتخفيف 29 ميكرولترا من خليط الخرزة هذا مع 721 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل. ثم أضف 75 ميكرولترا من الخرز المخفف و 25 ميكرولترا من البروتين المخفف في SSB إلى الآبار واخلطها.
في حالة قياس الستين في حالة مستقرة ، احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، ثم قم بتصويره إما عن طريق الفحص المجهري القريب من TIRF أو الفحص المجهري متحد البؤر.