JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 4:08 د • July 8th, 2025
تكوين الأوعية الدموية هو تكوين أوعية دموية جديدة من الأوعية الدموية الموجودة أثناء الظروف التنموية والمرضية. يعد التواصل المكثف بين الخلايا البطانية التي تبطن السطح الداخلي للأوعية الدموية والخلايا المحيطة - الخلايا الداعمة على الجانب الخارجي من الأوعية الدموية - أمرا بالغ الأهمية لتكوين الأوعية.
لدراسة تكوين الأوعية الدموية في المختبر ، ابدأ بالخلايا البطانية والخرز الناقل الدقيق المطلي بالخلايا المحيطة المعلقة في محلول الفيبرينوجين - وهو بروتين سكري قابل للذوبان يعمل كسلائف الفيبرين.
الآن ، قم بوضع معلق الخرزة في صفيحة استزراع تحتوي على محلول من الثرومبين - إنزيم محلل للبروتين ، واحتضانه. يرتبط الثرومبين بجزيء الفيبرينوجين ، مما يتسبب في انقسامه لتكوين مونومرات فيبرين غير قابلة للذوبان ، مكونا هلام الفيبرين البوليمري. تضمن هذه الخطوة تضمين الخرز المطلي بالخلايا في هلام الفيبرين.
بعد ذلك ، ضع مزرعة الخلايا الليفية - خلايا سلائف النسيج الضام - فوق هلام الفيبرين واحتضانها للسماح بتنشيط الخلايا الليفية.
أثناء الحضانة ، تفرز الخلايا الليفية عوامل نمو الأوعية الدموية الحاسمة التي تؤدي إلى تنشيط الخلايا البطانية. مجتمعة ، تفرز الخلايا المحيطة الملتصقة والخلايا البطانية جزيئات الإشارات التي تساعد في إنبات الخلايا البطانية في هلام الفيبرين.
تظهر البراعم البطانية على شكل نتوءات خلوية ممدودة ملفوفة بالفطريات ، تصور المرحلة المبكرة من تكوين الأوعية.
افحص أطباق الخرز المطلي بالناقل الدقيق تحت المجهر بتكبير 20 مرة للتأكد من أن جميع الخرزات قد تم تغطيتها بشكل كاف بواسطة الخلايا البطانية.
انقل الألواح إلى غطاء التدفق الرقائقي ، واستخدم ماصة P1000 لشفط وتوزيع محاليل الخرز المطلية بقوة لفصل الخلايا عن قيعان اللوحة ، ونقل المواد الطافية إلى أنابيب فردية.
اترك الخرزات تستقر في قيعان الأنابيب لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، استخدم الماصة P1000 لإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية دون إزعاج مجموعات الخرز. أعد تعليق الخرزات في مليلتر واحد من الوسط الكامل لكل أنبوب ، واترك الخرزات تستقر لمدة 30 إلى 60 ثانية. استخدم الماصة P1000 لشفط المادة الطافية مرة أخرى، واغسل الخلايا البطانية العائمة بحرية من تعليق الخرزة بوسط كامل جديد، مرتين أخريين، كما هو موضح للتو.
بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخرز في 2.5 مل من محلول الفيبرينوجين. أضف 13 ميكرولترا من محلول الثرومبين لكل بئر ، في لوح سفلي زجاجي 24 بئرا. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من محلول الخرزة / الفيبرينوجين إلى كل بئر ، مع الحرص على ماصة الخرز بعناية مباشرة في الثرومبين ، والماصة ببطء لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات لخلط المحاليل جيدا.
عندما يتم زرع جميع الآبار ، اترك محلول الثرومبين والفيبرينوجين بالتجلط مسبقا في غطاء التدفق الصفحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، انقل اللوحة بعناية إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1.5 إلى 2 ساعة إضافية.
عندما يتجمد الجل تماما ، قم بتعليق الخلايا الليفية الطبيعية للرئة البشرية عند تركيز 2 × 104 خلايا لكل مليلتر في وسط كامل ، وأضف ملليلترا واحدا من الخلايا الليفية إلى كل بئر. ثم أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا.