مقايسة محللة الخلايا الأميبينية المضطربة: تقنية للكشف عن تلوث السموم الداخلية وقياسها في الأدوية النانوية

السموم الداخلية ، وهو سم بكتيري سالب الجرام موجود على الغشاء الخارجي ، هو عديد السكاريد الدهني ، LPS ، يتكون بشكل أساسي من الدهون والسكريات ، بما في ذلك الدهون A ومستضد O. عندما يتم إطلاقه أثناء الإصابة ، يتم التعرف عليه من قبل الجهاز المناعي ، مما يؤدي إلى استجابات التهابية قائمة على السيتوكين.

لتقدير تلوث السموم الداخلية في تركيبة نانوية للدواء الشحمي باستخدام محللة الخلايا الأميبينية Limulus ، LAL ، الفحص ، قم بإعداد أنابيب تفاعل ، إحداها تحتوي على الدواء والأخرى تحتوي على الدواء بتركيز سموم داخلية معروفة.

أضف كاشف LAL الذي يحتوي على محللة البروتين التي تم الحصول عليها من سلطعون حدوة الحصان أو Limulus polyphemus أو خلايا الدم أو الخلايا الأميبية. يشتمل المحلل على بروتياز سيرين غير النشط - العامل B ، والعامل C ، وإنزيم التخثر - وبروتين تخثر الهلام ، التخثر.

قم

بتدوير الأنابيب وتحميلها في مقياس التعكر لقياس تعكر المحاليل.

في حالة وجود LPS ملوث مرتبط بالأدوية الشحمية ، يتم تنشيط العامل C الحساس ل LPS تلقائيا ، والذي ينقق وينشط العامل B الذي يحول الإنزيم المؤيد للتخثر إلى إنزيم تخثر. يشق هذا الإنزيم المنشط روابط ببتيد التخثر ، مكونا مونومرات الكواغولين.

في النهاية ، تتبلمر المونومرات من خلال التفاعلات بين المناطق الكارهة للماء المكشوفة على رأس المرء وذيل آخر الكارهة للماء ، مما يؤدي إلى تجميع وتشكيل هلام الكواغلين العكر غير القابل للذوبان. تساعد العكارة المقاسة في تحديد تركيز السموم الداخلية في تركيبة النانو.

يشير التعافي التراكمي المحسوب من السموم الداخلية في عينات السن والاختبار ضمن النطاق المقبول إلى عدم وجود تداخل كبير من التركيبة النانوية ، مما يثبت وجود السموم الداخلية في الدواء النانوي التركيبي.

لإعداد معيار المعايرة ، استخدم 900 ميكرولتر من Limulus Amebocyte Lysate أو الماء من الدرجة LAL ، و 100 ميكرولتر من السموم الداخلية القياسية للتحكم ، لتحضير أكبر عدد ممكن من التخفيفات الوسيطة حسب الحاجة ، لتمكين إعداد معيار معايرة بتركيز وحدة سموم داخلية واحدة لكل مليلتر.

بعد ذلك ، باستخدام 900 ميكرولتر من الماء من الدرجة LAL و 100 ميكرولتر من معيار معايرة وحدة السموم الداخلية لكل مليلتر ، قم بإعداد معيار معايرة ثان بتركيز 0.1 وحدة السموم الداخلية لكل مليلتر.

بعد ذلك ، كرر التخفيف التسلسلي بمقدار 10 أضعاف لإعداد معيارين أقل للمعايرة ، للحصول على ما مجموعه أربعة معايير معايرة تتراوح من 0.001 إلى 1 وحدة السموم الداخلية لكل مليلتر.

لتحضير وحدة السموم الداخلية 0.05 لكل مليلتر ، اجمع بين 50 ميكرولترا من وحدة السموم الداخلية لكل مليلتر من محلول السموم الداخلية القياسي للتحكم مع 950 ميكرولتر من الماء من الدرجة LAL.

بعد ذلك ، في البرنامج ، حدد "إعدادات الأداة" ، وقم بإنشاء القالب. حدد "جمع البيانات" ، وأدخل معرف الاختبار ومجموعة البيانات في علامة التبويب "عام". ضمن علامة التبويب "الأجهزة" ، حدد نوع الأداة وطريقة LAL ، وتحقق من ظهور الرقم التسلسلي ومعرف النظام ومعلومات المنفذ التسلسلي على الشاشة.

انقر فوق "موافق" مرتين لتأكيد اختيار الأداة والاتصال بالأداة ، وأدخل معرفات العينة بنفس الترتيب الذي سيتم فيه اختبار العينات. بعد ذلك ، استخدم الأزرار الافتراضية لإدخال عنصر التحكم السلبي والمنحنى القياسي وعينات الاختبار.

أضف الحجم المناسب لمعايير معايرة التحكم السلبي ومراقبة الجودة في أنابيب زجاجية مكررة مسبقة التصنيف ، وأضف الحجم المناسب من LAL إلى قارورة الاختبار الأولى. دوامة القارورة لفترة وجيزة ، ووضع القارورة في فتحات الاختبار المناسبة في دائري الأداة.

قبل تحميل العينات ، قم بإجراء عدة عمليات تخفيف لمادة الاختبار النانوية ضمن الحد الأقصى للتخفيف الصالح كما هو موضح.