فحص الإنزيم القائم على الكتلة الحيوية الكروموجينيك غير القابل للذوبان: اختبار لتقييم نشاط التحلل للإنزيمات المهينة للكتلة الحيوية النباتية

الكتلة الحيوية هي مادة عضوية مشتقة من النباتات تتكون بشكل أساسي من عديد السكاريد المعقد. تعمل الإنزيمات المهينة للكربوهيدرات على هذه السكريات لإنتاج السكريات قليلة السكاريد الأصغر.

لتقييم نشاط التحلل للإنزيم ، ابدأ بأخذ ركائز الكتلة الحيوية الملونة غير القابلة للذوبان - ICB الموجودة في آبار لوحة التفاعل المسامية. يتم الحصول على هذه الركائز من صباغة المواد المشتقة من النباتات بصبغة كلوروتريازين بلون معين. تحتوي الكتلة الحيوية الناتجة على السكريات المعقدة ذات العلامات الصبغية التي تعمل كركيزة لنشاط الإنزيم.

الآن ، أضف محلولا عازلا يحتوي على إنزيم تحلل الكربوهيدرات. يحافظ المخزن المؤقت على الأس الهيدروجيني لتحقيق نشاط الإنزيم الأمثل. ضع لوحة التفاعل على شاكر ، واحتضنها. يسمح التحريض المستمر لجزيئات الإنزيم بالوصول إلى عديد السكاريد المستهدف في ركيزة ICB.

أثناء الحضانة ، يشق إنزيم التحلل المائي روابط جليكوسيدية تساهمية داخل السكريات طويلة السلسلة. ينتج عن التفاعل السكريات قليلة الذوبان المرتبطة بجزيئات الصبغة ، والتي تبقى في المحلول.

عند الانتهاء من التحلل ، ضع لوحة التفاعل فوق لوحة المنتج وقم بالطرد المركزي للتجميع. أثناء الطرد المركزي ، يمر المحلول الملون الذي يحتوي على منتجات التفاعل عبر المرشح الموجود أسفل اللوحة ، ويتم جمعه في لوحة المنتج. باستخدام قارئ اللوحة ، سجل امتصاص المادة الطافية.

تشير

قيمة الامتصاص الأعلى إلى توليد عدد كبير من السكريات قليلة السكاريد المرتبطة بالصبغة - مما يشير إلى كفاءة الإنزيم في تحطيم ركيزة ICB.

لإجراء الفحص الكروموجينيكي باستخدام الكتلة الحيوية الملونة الحمراء غير القابلة للذوبان ، أو قش القمح ICB ، ابدأ بإضافة 200 ميكرولتر من محلول التنشيط إلى كل بئر من لوحة الفحص. ثم احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة ، دون إثارة لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة المثبت باستخدام 100 ميكرولتر من الماء المعقم لغسل الآبار ثلاث مرات. ثم أضف 150 ميكرولترا من محلول أسيتات الصوديوم 100 مللي مولار، ودرجة الحموضة 4.5، و5 ميكرولترات من 10 وحدات لكل مليلتر من محلول إندو-زيلاناز مختلف.

ضع لوحة المنتج أسفل لوحة الركيزة لجمع أي تسرب محتمل من لوحة الركيزة أثناء الاهتزاز ، واحتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة و 100 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين.

بعد الحضانة ، ضع لوحة مجموعة الفحص ، مع لوحة المنتج تحتها ، في جهاز الطرد المركزي ، وقم بالدوران لأسفل عند 2,700 × جم لمدة 10 دقائق لنقل منتج التفاعل في آبار لوحة المنتج.

تأكد من أن حجم السائل في كل بئر متماثل تقريبا. ثم ، باستخدام قارئ الألواح ، اقرأ امتصاص لوحة التجميع عند 517 نانومتر لقش القمح ICB الأحمر.